复合代糖的通便功效及其对肠道菌群的调节作用

李国坤，董嘉华，肖健海，白思晓，陈骁熠，苏立杰

（广州医科大学公共卫生学院，广东广州 511436）

慢性便秘（Chronic Constipation, CC）是临床最常见的胃肠道病症之一，表现为持续2周或更长时间排便困难，在全球范围内的发病率为15%[1,2]，我国的便秘发病率大概在3%～17%[3]。慢传输型便秘（Slow Transit Constipation，STC）是慢性便秘的一种主要类型，其特点是肠道运输时间显着增加、肠道运动功能障碍[4]。大部分STC患者会有恶心、腹胀、食欲不振、情绪低落等症状，严重者可能还出现结肠癌、直肠癌等病症[5]。导致STC的结肠动力障碍的潜在机制尚不清楚。大量研究表明，STC患者会发生多种生理变化，包括结肠Cajal的间质细胞（Interstitial cells of Cajals，ICC）减少、肠神经系统异常、肠道平滑肌收缩功能异常等[6]。现有的治疗方法主要有泻药、抗炎药等药物治疗和结肠切除术与回肠直肠吻合术等手术治疗，但都有着严重的副作用和不良反应[7]。

肠道菌群是一个复杂的生态系统，在维持宿主的健康和生理功能方面起着关键作用[8]。根据近些年的研究，STC患者的肠道菌群生态系统与健康人群相比均出现不同程度的破坏。其中STC患者肠道菌群的组成相较于健康人群出现了较大的不同：粪便中的双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、肠杆菌等出现了异常变化[9]。在动物研究中发现，可以通过增加肠道内有益菌、减少肠道内有害菌来改善STC小鼠的便秘情况[10-14]。这提示我们可以通过调节肠道菌群来干预STC[15,16]。

代糖是低热量的甜味剂，具有甜度高、热量低、不易发生龋齿、安全性高等特性。研究不同代糖的功能特性是如今食品研究的热点之一[17]。一种代糖常存在功能单一、口感不好等缺陷，因此市面上常采用多种代糖复合。本研究所采用的复合代糖由赤藓糖醇、菊粉、甜菊糖苷、罗汉果苷组成。研究表明，菊粉、罗汉果苷具有润肠通便效果[18]，菊粉可有效的改善肠道菌群紊乱[19-22]，甜菊糖苷可促进双歧杆菌和乳酸杆菌生长[23]。这提示复合代糖可能有通便作用和调节肠道菌群作用。所以本研究拟通过小鼠实验和菌群体外增殖实验，探究该复合代糖是否能显著改善小鼠的便秘情况和探究其对小鼠肠道菌群的影响。本研究探究复合代糖的通便效果及其对肠道菌群的作用，为STC患者的治疗和功能型食品的开发提供了新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复合代糖，广州莱品健康科技有限公司（产品标准号：GB26687；生产许可证编号：SC1244419014023）；阿拉伯树胶，天津市福晨化学试剂厂；酚酞，亚宝药业集团股份有限公司；羧甲基纤维素钠，国药集团化学试剂有限公司；盐酸洛哌丁胺胶囊，西安杨森制药有限公司；氯化钠，无锡市亚泰联合化工有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-250B微机生化培养箱，上海悦丰仪器仪表有限公司；FE20pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；T6773电子天平，普利赛斯科学仪器有限公司（瑞士）；ZHJH-C1106B超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；MULTISKAN GO全自动酶标仪，广东丹利科技有限公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌机，日本三洋；纯水机，南京贝登医疗股份有限公司；DZF-6050真空干燥，上海-恒科学仪器有限公司。

1.3 动物及动物粪便

SPF级Balb/c小鼠，雄性，体质量22±2 g，合格证号：NO. 44007200049595，许可证号：SCXK(粤)2013-0002，由广东省医学实验动物中心提供。

1.4 动物实验方法

1.4.1 试剂的配制

取9 g氯化钠粉末溶于1 L纯水，高温灭菌，即得0.9%的生理盐水。

取32 mg洛哌丁胺粉末溶于32 mL生理盐水，配成1 mg/mL的洛哌丁胺溶液。

取20 mg酚酞粉末溶于4 mL生理盐水，配成5 mg/mL的酚酞溶液。

分别取0.25 g、0.45 g、0.675 g、0.9 g、1.125 g复合代糖溶于3 mL生理盐水中，分别配成0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL复合代糖溶液。分别作为小鼠G1、G2、G3、G4、G5组的干预试剂。

取10 g阿拉伯树胶溶于100 mL纯水中，煮沸至透明后，加入5 g碳粉，混匀再煮沸即可得。

1.4.2 小鼠灌胃实验

小鼠适应性喂养5 d后随机分成8组，每组8只，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组和复合代糖干预G1组（0.75 g/kg·BW）、G2组（1.5 g/kg·BW）、G3组（2.25 g/kg·BW）、G4组（3 g/kg·BW）、G5组（3.75 g/kg·BW）。根据各组小鼠体重按量给药，模型组、阳性对照组和G1组（0.75 g/kg·BW）、G2组（1.5 g/kg·BW）、G3组（2.25 g/kg·BW）、G4组（3 g/kg·BW）、G5组（3.75 g/kg·BW）分别给予10 mg/kg·BW的盐酸洛哌丁胺溶液，空白对照组给予相应的生理盐水。0.5 h后，按照体重给予空白对照组、模型组生理盐水，阳性对照组给予50 mg/kg·BW的酚酞溶液，复合代糖组给予相应浓度的复合代糖。按时对其进行14 d的灌胃实验。

1.4.3 小鼠黑便实验

灌胃实验进行14 d后，各组小鼠禁食不禁水12 h。空白对照组灌胃给予生理盐水，阳性对照组、模型组和复合代糖组灌胃给予10 mg/kg·BW的盐酸洛哌丁胺溶液。在0.5 h后，按照体重给予空白对照组、模型组生理盐水，阳性对照组给予50 mg/kg·BW的酚酞溶液，复合代糖组给予不同浓度的代糖溶液，并给予0.2 mL的墨汁。从每只小鼠的墨汁灌胃时间开始，记录每只动物首粒排黑便时间、在6 h内排粪便粒数和粪便重量。

1.4.4 墨汁推进率实验

黑便实验后，各组小鼠禁食不禁水12 h。阳性对照组、模型组和复合代糖组给予0.2 g/mL的盐酸洛哌丁胺溶液，空白对照组给予蒸馏水灌胃。给予洛哌丁胺0.5 h后，按照体重给予空白对照组、模型组生理盐水，阳性对照组给予3 mg/mL的酚酞溶液，复合代糖组给予不同浓度的代糖溶液，并给予0.2 mL的墨汁。在每只小鼠灌墨汁30 min后立即脱颈椎处死，用镊子剪开腹腔，将幽门至盲肠的肠管剪取，置于洁净实验台上，将其拉成直线测量长度，记为小肠总长度，将幽门至墨汁前沿处记为墨汁推进长度。按下列公式计算墨汁推进率：

墨汁推进率/%=墨汁推进长度（cm）÷小肠总长度（cm）×100%

1.5 菌群体外增殖实验方法

1.5.1 培养基的制备

分别用TPY琼脂培养基、EBM培养基、BEA琼脂培养基、BBL琼脂培养基作为乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌的选择培养基。称取复合代糖10 g于离心管中，加入10 mL水，混合均匀，紫外线照射30 min灭菌，即得1 g/mL的代糖溶液。用1 g/mL的代糖溶液和营养肉汤培养基配制成0.075、0.15、0.225、0.3、0.375 g/mL的代糖培养基。

1.5.2 试验用菌种分离

准备一个5 mL无菌EP管，使用无菌棉签接取小鼠排出的新鲜粪便，转入管内称重，记录下粪便的质量为m。加入99倍m的无菌生理盐水，与小鼠的粪便混匀。得10-2粪便稀释液，依次用生理盐水稀释成10-3、10-4和10-5。将浓度为10-3、10-4和10-5的粪便稀释液涂布于四种不同的选择培养基上，放入37 ℃的微生物培养箱里，培养的时间为24～48 h。参考《伯杰氏系统细菌学手册》第九版，在单菌落明显以及菌落数在20～30 CFU的平板里进行菌种鉴定和分离。将密度为108 CFU/mL的目标菌接种在0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL的代糖培养基上，37 ℃下培养24 h。在600 nm的波长下，每2 h测定一次菌液的OD值。

1.6 数据处理与统计分析

所有数据均独立平行测定，数据结果以平均值±标准差的形式表示，采用SPSS 24.0软件对试验数据进行统计学分析，通过独立样本t检验和单因素方差检验做显著性分析，p＜0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 复合代糖对小鼠体重的影响

将实验前各组小鼠的体重与模型组进行比较，如表1所示，没有出现显著差异（p＞0.05），说明实验前小鼠的分组具有一定的科学合理性。比较实验后各组小鼠与空白组的体重，体重没有出现显著的差异（p＞0.05），说明灌胃10 mg/kg·BW洛哌丁胺14 d对小鼠来说不会产生严重的影响。姚一博等在洛哌丁胺给药剂量和造模时间对小鼠慢传输型便秘模型建立的研究中，0.5 mg/kg·BW～50 mg/kg·BW给药浓度和3 d～14 d的造模时间都未出现小鼠体重下降的情况[24]。这也与Ren X和Li C等研究中洛哌丁胺对体重无太大影响的结果研究一致[10,12]。

表1 小鼠实验前后体重Table 1 Weight of mice before and after the experiment

世界卫生组织建议蔗糖的摄入量应该在总热量的10%以内[25]，而美国医学研究所建议蔗糖的能量占总热量的比应小于25%[26]。在美国2003～2006年的流行病学调查中，摄入蔗糖的占能比大于25%的人口达到了13%[27]；在南非，摄入蔗糖的占能比大于10%的人口超过了10%[28]。在瑞典，摄入蔗糖的占能比大于15%的人群超过了10.56%[29]。过量蔗糖摄入可能会导致龋齿、肥胖、2型糖尿病和心血管疾病等健康问题[30,31]，因此寻找能够代替蔗糖的功能性代糖是当今食品研究的热点之一。但一种代糖常存在功能单一、口感不好等缺陷，因此常采用多种代糖复合。本研究所用的复合代糖由赤藓糖醇、菊粉、甜菊糖苷、罗汉果苷组成。赤藓糖醇作为糖替代品广泛用于各种食品和口腔护理产品中，具有抗糖尿病、降血糖作用、抗龋齿作用[32]；菊粉是一种可溶性膳食纤维，具有促进消化，促进脂质代谢和维持葡萄糖和胰岛素水平功效[33]；甜菊糖苷是从甜叶菊植物的叶中提取的一种天然甜味剂，在Ilić V的研究中，低剂量甜菊糖苷对糖尿病小鼠有着维持血糖的功效[34]；罗汉果苷是从罗汉果果实中分离出的天然化合物，具有通便、降血糖、抗炎等功效[35]。由此可知，由赤藓糖醇、菊粉、甜菊糖苷、罗汉果苷混合的复合代糖可能会具有抗糖尿病、降血糖、通便、抗龋齿作用等功效。而在此次实验中，复合代糖干预组体重实验前后与空白组前后体重无显著性差异（p＞0.05），说明0.75 g/kg·BW、1.5 g/kg·BW、2.25 g/kg·BW、3 g/kg·BW、3.75 g/kg·BW剂量的复合代糖在灌胃14 d不会显著地引起小鼠的体重变化。

2.2 小鼠便秘模型的建立结果

将实验后空白对照组和模型组的各排便指标进行比较，如表2所示，模型组的首粒黑便时间（156.63 min）相对于空白对照组（63.75 min）显著增加（p＜0.05）；6 h排便粒数（11.75 n）相对于空白对照组（21.63 n）显著减少（p＜0.05）；6 h粪便重量（0.19 g）相对于空白对照组（0.29 g）显著减少（p＜0.05）；墨汁推进率（38.45%）相对于空白对照组（70.58%）显著减少（p＜0.05）。国内外研究表明洛哌丁胺剂量在2 mg/kg·BW～20 mg/kg·BW、给药时间在4 d～42 d均有成功建立小鼠便秘模型的案例[24,36]。根据小鼠便秘模型建立的判定：干预组首粒黑便时间、6 h排便粒数、6 h粪便重量、墨汁推进率与空白组具有显著性差异，可说明该小鼠便秘模型成功建立[37,38]。所以可判定此次用10 mg/kg·BW的盐酸洛哌丁胺溶液灌胃14 d的小鼠便秘模型成功建立。

表2 洛哌丁胺对小鼠各排便指标的影响Table 2 Effects of loperamide on various defecation indexes in mice

2.3 复合代糖对小鼠小肠墨汁推进率、首次黑便时间、排便粒数、6 h粪便重量的影响

比较各组与模型组的墨汁推进率，如表3所示，五组复合代糖干预组的墨汁推进率相对于模型组均显著增加（p＜0.05）。其中代糖G3组的墨汁推进率相对于模型组（38.45%）增加了49.41%，其次是代糖G5组增加了48.47%、代糖G4组增加了47.77%。将模型组与阳性对照组、代糖各组的各排便指标进行比较，如表4所示，发现阳性对照组和代糖各组的首粒黑便时间相对于模型组均显著减少，其中代糖G5组的首粒黑便时间相对于模型组（156.63 min）减少了67.25 min，其次是代糖G3组减少了57.50 min、代糖G4组减少了50.25 min。比较各组与模型组的6 h排便粒数，发现阳性对照组和代糖各组的6 h排便粒数相对于模型组均显著增加，其中代糖G2组的6 h排便粒数相对于模型组（11.75 n）增加了9.38 n，其次是代糖G5组增加了8.75 n、代糖G1组增加了8.38 n。比较各组与模型组的6 h粪便重量，发现阳性对照组和代糖各组的6 h粪便重量相对于模型组均显著增加，其中代糖G5组的6 h粪便重量相对于模型组（0.19 g）增加了0.20 g，其次是代糖G1组增加了0.14 g、代糖G2组增加了0.12 g。

表3 复合代糖对便秘小鼠小肠推进的影响Table 3 Effects of complex substitute sugar on intestinal propulsion in constipated mice

表4 复合代糖对小鼠各排便指标的影响Table 4 Influence of complex substitute sugar on various defecation indexes in mice

根据保健食品的通便功能检验方法：6 h排便粒数和6 h粪便重量任一项结果显著，同时墨汁推进率和首粒黑便时间任一项结果显著，可判定该受试样品对便秘小鼠具有通便功效[39]，所以可判定0.75 g/kg·BW、1.5 g/kg·BW、2.25 g/kg·BW、3 g/kg·BW、3.75 g/kg·BW剂量的复合代糖可显著的改善小鼠的便秘情况，不同剂量复合代糖的通便效果无显著的线性关系。比较五组复合代糖干预组通便结果，发现代糖G5组（3.75 g/kg·BW）的通便功效最为显著，相对于模型组，墨汁推进率增加了48.47%、首粒黑便时间减少了67.25 min、6 h排便粒数增加了8.75 n、6 h粪便重量增加了0.20 g。

菊粉是一种可溶性膳食纤维，在临床研究中，每天食用12～20 g的菊粉可通过增加慢性便秘患者的排便频率、降低粪便稠度有效地改善患者的病情[40-42]，而在动物实验中，1.0 g/kg·BW的菊粉未能有效地改善小鼠便秘情况，其阴性结果的原因可能是剂量太小[43]。罗汉果苷是罗汉果的主要成分，在陈瑶的研究中，300 mg/kg·BW、900 mg/kg·BW的罗汉果苷可通过减少首次排便时间和增加6 h粪便重量等来改善小鼠便秘情况[18]，其机制可能是通过减少血液中LPS内毒素的含量，从而修复肠屏障[44]。这提示我们该复合代糖中的菊粉和罗汉果苷可能是其通便作用的有效成分。

2.4 复合代糖对小鼠有益菌（双歧杆菌、乳酸杆菌）的影响

将小鼠粪便中分离出的双歧杆菌和乳酸杆菌接种在0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL复合代糖浓度的培养基，在600 nm的波长下OD值。由图1可得，对照组和5组不同浓度的复合代糖组在前8 h内双歧杆菌的数量相差不大。在8 h之后，0.375 g/mL代糖浓度组呈现近对数生长的趋势。另外，在8 h后，5组不同浓度的复合代糖组双歧杆菌数量均高于对照组，并有高浓度的复合代糖组双歧杆菌数量高于低浓度复合代糖组的趋势。由图2可得，对照组和5组不同浓度的复合代糖组在前6 h内乳酸杆菌的数量相差不大，在6 h之后，0.375 g/mL和0.3 g/mL代糖浓度组均呈现近对数生长的趋势，且5组不同浓度的复合代糖组在6 h后乳酸杆菌的数量均高于对照组，并有高浓度的复合代糖组乳酸杆菌的数量高于低浓度复合代糖组的趋势。这说明0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL浓度的复合代糖组均可促进双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，相较于双歧杆菌，复合代糖能更早地促进乳酸杆菌的增殖。并在0.075 g/mL至0.375 g/mL浓度内，复合代糖浓度越大，促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖的趋势越明显。

图1 复合代糖对双歧杆菌增殖的影响Fig.1 Effects of complex glucosubstitutes on the proliferation of bifidobacterial

图2 复合代糖对乳酸杆菌增殖的影响Fig.2 Effects of complex glucose on lactobacillus proliferation

人类的肠道微生物群非常复杂，其数量是宿主细胞的10倍，可帮助肠道吸收、分解和代谢各类营养物质，是维持机体正常运转的重要因素[45]。其中双歧杆菌、乳酸杆菌是人类和动物胃肠道中重要的益生菌。目前研究认为体内双歧杆菌与保护肠道粘膜、增加IgA数量、抑制肿瘤、改善便秘等密切相关[46]。而乳酸杆菌有着预防和改善便秘、治疗腹泻等功效，可通过饮食提高肠道内数量[47]。饮食是影响结肠微生物群组成和代谢的主要因素，饮食中的营养素数量、种类对肠道微生物群有很大影响[45]。菊粉是由重复果糖基单元组成的纤维，易被肠内细菌发酵，并产生大量短链脂肪酸（SCFA）。在每日的饮食外补充5 g～20 g菊粉，可检测到肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌的增加[48]。Wu X的研究表明，往小鸡的饮食中添加100～3200 mg/kg的甜菊糖苷，可检测到其肠道内双歧杆菌显著增加，并有促进乳酸杆菌生长的趋势[49]。这提示我们该复合代糖中的菊粉和甜菊糖苷可能是其扶植作用的有效成分。

2.5 复合代糖对小鼠有害菌（肠杆菌、肠球菌）的影响

肠杆菌和肠球菌是人和动物肠道内一类常见的致病菌，具有生殖力强、分布广等特点，常引起各类感染，研究其抑制方法是当今研究热点之一[50,51]。将肠杆菌和肠球菌接种在5种不同复合代糖浓度的培养基，在600 nm的波长下OD值。由图3可得，对照组和5组不同浓度的复合代糖组在前4 h内肠杆菌的数量相差不大。在4 h之后，0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL浓度的复合代糖组肠杆菌的数量均低于对照组。由图4可得，0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL浓度的复合代糖组肠球菌数量在24 h内均低于对照组。

图3 复合代糖对肠杆菌增殖的影响Fig.3 Effects of complex glucosubstitutes on the proliferation of Enterobacteriaceae

图4 复合代糖对肠球菌增殖的影响Fig.4 Effects of complex glucosubstitutes on enterococcus proliferation

肠杆菌适宜pH值在4.5～8.0之间，肠球菌喜在高盐高碱的环境生长，而菊粉、甜菊糖苷在进入肠道后会被益生菌分解，进而降低肠道内的pH值，从而抑制肠杆菌和肠球菌等有害菌的增殖。复合代糖对肠球菌的增殖抑制效果比肠杆菌明显，肠杆菌数量在4 h后才逐渐呈现出下降的趋势，这可能与肠杆菌不能在酸性环境中长时间存活，但可以在适度的酸性环境下生长有关。这与陈樱萌研究中槲皮素酸奶对小鼠肠道菌群的调节作用基本一致[52]。上述结果说明0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL浓度的复合代糖组均可抑制肠杆菌和肠球菌的增殖的增殖，而菊粉和甜菊糖苷可能是该复合代糖抑制其增殖作用的有效成分。

3 结论

本研究所采用的复合代糖由赤藓糖醇、菊粉、甜菊糖苷、罗汉果苷组成。通过小鼠实验，用洛哌丁胺建立便秘模型，酚酞和复合代糖进行干预，14 d后观察墨汁推进率、首粒黑便时间、6 h的排便粒数和6 h粪便重量等指标，评价复合代糖的通便效果。发现0.75 g/kg·BW、1.5 g/kg·BW、2.25 g/kg·BW、3 g/kg·BW、3.75 g/kg·BW剂量的复合代糖具有通便效果，可有效改善小鼠的便秘情况。其中3.75 g/kg·BW的通便功效最为显著，相对于模型组，墨汁推进率增加了48.47%、首粒黑便时间减少了67.25 min、6 h排便粒数增加了8.75 n、6 h粪便重量增加了0.20 g。而复合代糖中的菊粉和罗汉果苷可能是其通便作用的有效成分。另外，通过体外菌群增殖实验，动态观察空白组和复合代糖干预组双歧杆菌、乳酸杆菌和肠杆菌、肠球菌的数量变化，发现0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.225 g/mL、0.3 g/mL、0.375 g/mL浓度的复合代糖可促进肠道内有益菌双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖和抑制有害菌肠杆菌、肠球菌的增殖。并在0.075 g/mL至0.375 g/mL浓度内，复合代糖浓度越大，促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖的趋势越明显。复合代糖中的菊粉和甜菊糖苷可能是其促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖和抑制有害菌肠杆菌、肠球菌增殖的有效成分。综上所述，该复合代糖口感良好，具有通便功效，可调节肠道菌群，作为一种新型甜味剂，应用前景广阔。