桦褐孔菌乙醇粗提物对朊病毒复制的抑制作用

杨微，陈志宝,2,3，陈操，魏艳梅，夏影，戴好富

（1.黑龙江八一农垦大学，生命科学技术学院，黑龙江大庆 163000）（2.广东海洋大学滨海农业学院，广东湛江524088）（3.广东海洋大学深圳研究院，广东深圳 518108）（4.中国疾病预防控制中心，病毒病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206）（5.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 571101）

桦褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）又被称为桦树茸，隶属于担子菌门、蘑菇纲、锈革菌目、锈革菌科、褐卧孔菌属[1]，大多生长在白桦、银桦等桦树的树皮下，同时在其破损处形成肉瘤状的菌核，作为一种珍稀药用真菌，主要分布地区有北纬45～50 ℃芬兰、北美、俄罗斯的西伯利亚，以及中国黑龙江和吉林等地[2]。它具有许多药理活性，包括抵抗氧化应激[3,4]、阻止病原体入侵[5]、抑制肿瘤细胞生长[6]、产生抗炎因子[7]以及调节免疫功能[8]等作用，同时对多种疾病具有抑制作用，包括糖尿病、癌症、心血管疾病等[9]。此外，桦褐孔菌也被当作辅助品添加到中药材、调味品、饮料、加工类肉品以及作为天然食用色素加入到食品中[10]。由于其功效和广泛的应用，近年来对它的研究力度也在不断加大。

朊病毒病（Prion Diseases）亦称传染性海绵状脑病（Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSEs），是一类由朊病毒导致的可感染人和动物中枢神经系统的退行性疾病[11]。朊病毒可表现出与常规病毒不同的典型特征，对多种灭活作用显示出超强的抵抗能力。该病的潜伏期较长，病死率为100%，发病机制尚不明确[12,13]。迄今为止，没有有效的治疗性药物和预防性疫苗。研究表明桦褐孔菌可通过抑制氧化应激反应，起到保护神经细胞的作用[14,15]。在朊病毒病发生、发展过程中，同样存在氧化应激反应[16]，但尚未有文献报道桦褐孔菌或其提取物对朊病毒病具有抑制作用。本文旨在使用桦褐孔菌乙醇粗提物处理朊病毒感染的细胞，对其进行安全性评价，同时分析是否对朊病毒的复制具有抑制作用及其初步的作用机制，为朊病毒病的治疗提供新的方案。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）生药样品，俄罗斯贝加尔湖地区；感染朊病毒毒株Chandler且能稳定传代的细胞系SMB-S15，英国Roslin研究所。

CCK-8试剂盒，北京智杰方远科技有限公司；过氧化氢检测试剂盒、CuZn Mn-SOD活性检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司；蛋白酶K、硝酸纤维素（NC）膜，美国Merck公司；ECL显影试剂盒，美国Perkin-Elmer公司；PrP抗体，美国Santa Cruz公司；GCLC抗体、GCLM抗体，美国Proteintech公司；β-actin抗体，北京华兴博创生物技术有限公司；过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，美国Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 仪器与设备

细胞培养箱，德国Eppendorf公司；化学发光成像仪器，中国上海勤翔科学仪器有限公司生产的；恒温水浴锅，中国北京市精科华瑞仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桦褐孔菌乙醇粗提物的提取

选取质地均匀的桦褐孔菌干燥子实体，将其碎成适当的小块后使用粉碎机粉碎。称量干燥的桦褐孔菌粉末5 g，采用醇提法对其进行提取，过滤，取上清液，滤渣反复提取几次，合并滤液。采用旋转蒸发仪浓缩滤液，冷冻干燥机对其进行冷冻干燥，最终得到黄色浸膏状固体为桦褐孔菌乙醇粗提物。计算桦褐孔菌乙醇粗提物的得率。

桦褐孔菌乙醇粗提物得率公式按下列公式计算：

1.3.2 桦褐孔菌乙醇粗提物的正交试验

为了得到桦褐孔菌乙醇粗提物的最佳工艺条件，选择恰当的料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度进行4因素3水平正交试验，最终确定桦褐孔菌乙醇粗提物的最优提取工艺。L9(34)正交试验设计见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.3 桦褐孔菌乙醇粗提物抑制朊病毒复制作用及其抗氧化活性试验

1.3.3.1 制备桦褐孔菌乙醇粗提物样品

称量干燥的桦褐孔菌粉末样品，按照1.3.2确定的最优提取工艺获取乙醇粗提物。将其配置成质量浓度为5 mg/mL的母液，经0.22 μm滤膜过滤，分装后置于暗处保存备用。

1.3.3.2 SMB-S15细胞培养

使用10% FBS的DMEM培养基培养SMB-S15细胞，并置于33 ℃、5%的CO2恒温培养箱中，当细胞密度达到80%～90%左右时，按照1:2～1:5的比例传代。空白对照组不添加任何物质，试验组添加不同浓度的乙醇粗提物。

1.3.3.3 Western blot试验

细胞裂解后变性处理，使用12% SDS PAGE电泳跑胶，半干式电转仪转至NC膜，5%脱脂乳室温封闭孵育2 h，TBST润洗3次×10 min；再分别孵育PrP（6D11）、β-actin（1:5000稀释）抗体于4 ℃过夜，TBST润洗3次×10 min；室温孵育辣根过氧化物（HRP）标记羊抗鼠二抗（1:5000稀释）2 h，TBST润洗3次×10 min；ECL显色后，在化学发光成像仪中采集图像。

1.3.3.4 CCK-8试验

采用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。细胞处理不同浓度乙醇粗提物后，在96孔培养板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃反应1 h，于450 nm处酶标仪测吸光度值，计算细胞存活率。

1.3.3.5 H2O2、SOD及抗氧化因子检测

细胞处理后收集细胞沉淀块，按照每100万细胞加入100～200 μL过氧化氢检测裂解液的比例加入裂解液，随后充分匀浆以破碎并裂解细胞。4 ℃，12000 g离心5 min，取上清，按照H2O2检测试剂盒方法测定过氧化氢含量。

收集细胞，用4 ℃或冰浴预冷的PBS或生理盐水洗涤1～2遍。沉淀用预冷的PBS在4 ℃或冰浴进行匀浆(可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器)。随后匀浆液4 ℃离心，取上清，按照SOD检测试剂盒方法测定SOD抑制率。

抗氧化因子GCLM、GCLC的检测参照1.3.3.3实验方法

1.3.4 统计分析

本试验中绘图软件为GraphPad Prism。免疫印迹图像定量分析软件为Image J。采用t检验进行统计学分析。p＜0.05代表具有统计学意义，***代表p＜0.001，**代表p＜0.01，*代表p＜0.05，ns（no significance）代表无统计学意义。所有数值表示均为平均值±相对标准偏差。

工程管理专业实践性强，需要培养具备土建类工程技术以及管理、经济、法律等基本知识，能运用管理科学的理论、方法和手段，在工程建设和房地产领域从事工程技术、工程项目管理、工程咨询、房地产经营管理工作的应用型高级管理人才[1]。然而我国以学科教育为本位的普通高等教育达不到专业培养目标和就业要求[2～3]。目前，应用型本科工程管理专业教学模式主要存在如下问题：

2 结果与讨论

2.1 优化桦褐孔菌乙醇粗提物提取工艺

2.1.1 正交试验结果

利用正交试验对桦褐孔菌乙醇粗提物提取工艺进行优化，选择料液比（A）为1:6（A1）、1:8（A2）、1:10（A3），乙醇体积分数（B）为85%（B1）、80%（B2）、75%（B3），提取时间（C）为1.5 h（C1）、2.0 h（C2）、2.5 h（C3），提取温度（D）为60 ℃（D1）、70 ℃（D2）、80 ℃（D3）作为正交试验的优化条件。

正交试验结果如表2所示，以乙醇粗提物的得率为考察依据，通过测定所得的数据分析表明，乙醇粗提物得率的主要影响因素顺序为A＞C＞D＞B，对乙醇粗提物的得率影响最大的是（A）料液比，得率最高时的料液比为1:10；对乙醇粗提物的得率影响最小的是（B）乙醇体积分数，得率最高时乙醇体积分数为75%。基于正交试验结果，确定乙醇粗提物的最优提取条件为A3B3C2D3（料液比1:10，乙醇体积分数75%，提取时间2 h，提取温度80 ℃）。

表2 正交试验结果Table 2 The experimental results of orthogonal test

2.2 桦褐孔菌乙醇粗提物抑制朊病毒复制作用及其抗氧化活性研究

2.2.1 SMB-S15细胞中PrP蛋白的检测

朊病毒病的致病因子为朊病毒（PrPSc），它具有感染性，不溶性及部分抗蛋白酶K（protein K，PK）消化的能力[17]。根据PrPSc这一特性，利用Western blot检测蛋白酶K处理后SMB-S15细胞裂解液的朊蛋白（PrP）特异性条带，便可观察到PrPSc含量的变化。为了验证SMB-S15细胞中的PrPSc，利用20 ng/mL的蛋白酶K处理细胞，随后对其进行PrP蛋白检测。结果如图1所示，经蛋白酶K处理后，SMB-S15细胞仍能检测到PrP特异性条带。该结果表明，SMB-S15细胞含有朊病毒PrPSc。

图1 SMB-S15细胞蛋白酶K处理前后PrP蛋白变化情况Fig.1 Evaluation of PrP protein in SMB-S15 cells before and after treatment with proteinase K

药物本身以及高浓度可能会对细胞产生毒性作用。为了避免这种情况，本试验通过CCK-8方法检测乙醇粗提物对细胞存活率的影响，选择对细胞无毒副作用或毒副作用较小的安全质量浓度范围作为给药质量浓度。乙醇粗提物的细胞安全性评价结果如图2所示，采用CCK-8试验检测24 h的细胞存活率，结果显示当药物质量浓度为6.25×10-4mg/mL时，SMB-S15细胞的存活率为89.33%；而当药物质量浓度为1.25×10-3mg/mL，细胞存活率下降至87.33%，故最终得到乙醇粗提物的最大安全质量浓度范围为6.25×10-4mg/mL。

图2 桦褐孔菌乙醇粗提物细胞安全性评价Fig.2 Evaluation of cellular safety of ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

2.2.3 桦褐孔菌乙醇粗提物对朊病毒复制的影响

据报道，桦褐孔菌生粉及提取物会对一些神经退行性疾病具有保护作用，包括阿尔兹海默症[18]、帕金森综合征[19]、血管性痴呆[20,21]等，但桦褐孔菌对朊病毒病是否具有作用尚未有文献报道。本试验基于细胞安全性评价结果，使用Western blot试验方法进一步检测乙醇粗提物对朊病毒复制的影响。结果如图3所示，不同质量浓度乙醇粗提物处理SMB-S15细胞24 h，结果显示乙醇粗提物对PrPSc的复制具有抑制作用，且呈现剂量依赖性，药物质量浓度为6.25×10-4～3.91×10-5mg/mL时，与对照组相比具有统计学差异。综上，在安全质量浓度范围内乙醇粗提物对朊病毒感染细胞SMB-S15处理24 h后，对朊病毒的复制具有抑制作用。本试验初步探究了乙醇粗提物对朊病毒复制的抑制或清除作用，这种作用可能是由于乙醇粗提物具有较强的抗氧化活性，直接或间接影响朊病毒的复制，但其具体作用机理目前尚不明确。

图3 桦褐孔菌乙醇粗提物抑制复制朊病毒作用Fig.3 Inhibition of prion replication by ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

2.2.4 桦褐孔菌乙醇粗提物的抗氧化活性

先前有文献证明，桦褐孔菌生粉及其提取物均具有较强的抗氧化活性[22,23]。为了进一步探究桦褐孔菌乙醇粗提物是否通过其抗氧化作用从而抑制朊病毒的复制，本试验检测H2O2、SOD、GCLC、GCLM的水平。先前有研究证明，朊病毒感染的细胞中ROS的水平会明显升高[16]，当机体遭受各种有害刺激时，体内的高活性物质如活性氧（ROS）会大量产生，导致机体发生损伤。过氧化氢为ROS中的一类主要物质，首先利用H2O2检测试剂盒对细胞内的H2O2水平进行检测，结果发现随着乙醇粗提物质量浓度的增加，其含量也逐渐减少，药物质量浓度为6.25×10-4～1.56×10-4mg/mL时，与对照组相比具有统计学差异（图4）。该结果表明，乙醇粗提物能够降低SMB-S15细胞中的超氧化物，抵抗氧化应激产生的有害刺激。

图4 桦褐孔菌乙醇粗提物处理SMB-S15细胞后H2O2水平分析Fig.4 H2O2 levels analysis of SMB-S15 cells treated with ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

为了进一步确定乙醇粗提物是通过抗氧化作用抑制朊病毒的复制，本试验检测了几种抗氧化因子。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内重要的酶之一，是机体内氧自由基的主要清除者，近年来成为许多氧化应激引起的疾病的研究靶点。谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基（GCLC）及谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚基（GCLM）是体内还原性谷胱甘肽合成的限速酶，可以促进谷胱甘肽的合成，增强细胞的抗氧化能力[24]。结果显示，随着乙醇粗提物质量浓度的增加，SOD的抑制率也逐渐增加，且在6.25×10-4mg/mL时具有统计学意义（图5a）；GCLC及GCLM的蛋白含量也逐渐增加（图5b）。以上结果表明，在抑制朊病毒复制作用的过程中，桦褐孔菌乙醇粗提物的抗氧化活性发挥了作用。

图5 桦褐孔菌乙醇粗提物处理细胞后抗氧化因子水平分析Fig.5 Antioxidant factor levels analysis of SMB-S15 cells treated with ethanol crude extracts from Inonotus obliquus

3 结论

3.1 本研究以桦褐孔菌生粉为原料，利用醇提法提取桦褐孔菌乙醇粗提物，正交试验确定最佳提取条件。此外，采用CCK-8试验，对桦褐孔菌乙醇粗提物进行细胞安全性评价，得到其最大安全质量浓度为6.25×10-4mg/mL；在此安全质量浓度下，使用Western blot试验，发现处理24 h后对朊病毒的复制具有抑制作用；通过检测H2O2和几种抗氧化因子，初步探究了这种抑制作用可能是通过其抗氧化活性产生的。

3.2 本试验初步探究了桦褐孔菌对朊病毒病的影响及其潜在的作用机制，证明了桦褐孔菌乙醇粗提物对朊病毒病的致病因子PrPSc的复制具有抑制作用，且这种抑制作用是通过抗氧化活性产生的，但对于抗氧化作用机制的具体信号通路尚未清楚，还有待进一步研究。桦褐孔菌作为一种天然产物，既能当做食品添加剂，也可作为保健品，且毒副作用较小，这对未来的食品开发及疾病治疗方面都有很大的潜力。本试验为朊病毒病的治疗提供了理论依据，同时也为后续桦褐孔菌对神经保护方面的研究奠定了科学基础。