不同时期花生茎叶中芳樟醇含量的测定

欧可可，张平平，2，*，丽蕊，赵晓彤，王洪杰

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

花生茎叶为豆科落花生属（Arachis）植物落花生（A.hypogaea）的地上部分[1]，我国是花生生产大国，每年产生花生茎叶约有200万吨（干重）[2]，但花生茎叶主要作为动物饲料以及燃料使用，甚至很大一部分被直接丢弃，造成了极大的浪费。研究表明，从花生茎叶中分离得到的化合物主要有有机酸类、油脂类、脂肪烷烃类、多酚类以及芳樟醇类物质[3]，具有镇静催眠[4-8]、降压[9]、抗氧化[10-11]等作用。早在明洪武年间，我国民间就有花生茎叶入药的记载，近代编纂的《中药大辞典》中明确记载花生茎叶具有治疗抑郁、焦虑和失眠的功效，以及《中华本草》中提到花生叶水提液250 g/kg灌胃不引起小鼠死亡。邓磊等[12-13]研究发现花生茎叶中芳樟醇是改善睡眠的物质基础之一，能够显著干预小鼠大脑中与睡眠相关的4条信号通路，从而实现对睡眠的积极调控。民间不少地方的人们也常将花生叶水煮后饮用，以缓解失眠多梦。

近年来，花生茎叶助眠的研究主要集中在对花生茎叶挥发性油成分的鉴定及花生茎叶经水提和有机溶剂提取后，在动物助眠实验方面的简单对比，针对助眠成分提取的工艺优化及提取物中的助眠成分分析涉及较少。因此本研究以助眠成分之一芳樟醇为检测指标，采用茎叶分离的方式，在单因素试验的基础上，对花生叶中助眠成分芳樟醇的提取及测定条件进行优化，从而提高花生叶中芳樟醇的溶出率，并分析比较初花期和成熟期花生茎、叶中芳樟醇的含量差异及变化，以期为花生茎叶相关助眠产品的开发提供理论依据和参考，促进花生茎叶资源的综合、高效利用，为失眠症患者日常非医改善睡眠提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

初花期、成熟期花生茎叶：自采于山东省济宁市泗水县张庄镇；芳樟醇标准品：纯度≥99%，艾勒科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；乙腈（色谱纯）：天津市圣信唯科技有限公司。

1.2 仪器与设备

400A多功能粉碎机：永康市红太阳机电有限公司；DHG-9625A热风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；CA-1115旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；LGJ-18S真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；Milli-Q纯水仪：天津奥佳科技股份有限公司；Agilent1260高效液相色谱仪（配紫外检测器）：安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法与步骤

1.3.1 芳樟醇标准溶液的配制

精密称取芳樟醇标准品20.00 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，加入无水乙醇使其溶解，并定容至刻度，摇匀，制得4 mg/mL的芳樟醇标准溶液，再准确吸取4 mg/mL芳樟醇标准溶液250 μL至10 mL的容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，摇匀，得0.1 mg/mL的芳樟醇标准品溶液作为母液，4℃下避光存放备用。

1.3.2 样品制备

将收获的初花期和成熟期的花生茎叶，清洗后热风干燥至水分含量至5%，分别将茎叶分离、粉碎，过40目～60目筛，分别经料液比 1∶100（g/mL），90℃热水浸提2次，每次20 min，纱布过滤，合并2次滤液，将滤液经旋转蒸发仪浓缩15倍后，4 000 r/min离心10 min，取上清液，置于-80℃冰箱冷冻过夜，再经真空冷冻干燥得花生茎、叶冻干粉。

分别精密称取1.00 g初花期、成熟期花生茎、叶冻干粉末，置具塞比色管中，向花生叶冻干粉中分别加入无水乙醇8 mL，花生茎冻干粉中分别加入无水乙醇5 mL，摇匀，取上清液，过0.2 μm滤器，即得。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：Venusil XBP C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为以乙腈∶水=1∶1（体积比）；流速1.0 mL/min，紫外检测波长为205 nm，柱温为30℃，进样量10 μL。

1.3.4 方法学考察

分别从0.1 mg/mL芳樟醇标准品母液中准确吸取20、40、60、80、100 μL 至 10 mL 棕色容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，制成梯度浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL芳樟醇标准品溶液，按1.3.3的色谱条件进样测定，以制作标准曲线。

分别取同一芳樟醇标准品溶液、同一样品溶液、1.3.2条件下平行制备的6份样品溶液及加标样品溶液（精密称取6份已知芳樟醇含量的花生叶冻干粉0.50 g，分别准确加入0.1 mg/mL芳樟醇标准品溶液20 μL）在1.3.3的最优色谱条件进行分析检测，根据芳樟醇色谱峰的峰面积计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），以此分析精密度、稳定性、重复性及样品加标回收率。

1.3.5 花生叶中芳樟醇提取条件的优化

1.3.5.1 单因素试验

将干燥后的花生叶经粉碎机粉碎，分别过20～40、40～60、60～80、80～100 目筛后，称取适量花生叶干粉，以水作为提取溶剂，在料液比分别为 1 ∶50、1 ∶70、1 ∶100、1 ∶125、1 ∶150（g/mL），提取温度分别为 80、85、90、95、100 ℃，提取时间分别为 5、10、20、30、40 min 的提取条件下，提取2次进行单因素试验，再将滤液分别合并、浓缩、冻干、复溶后，经高效液相色谱测定芳樟醇含量，分别考察不同提取条件对花生叶中芳樟醇含量的影响。

1.3.5.2 正交试验

在单因素试验基础上，设计L9（34）正交试验优化提取条件，分别考察粉碎度、料液比、提取温度、提取时间对花生叶中芳樟醇含量的影响，以确定最佳提取条件，正交试验因素和水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Test factors of orthogonal experiment levels table

1.4 数据统计分析

数据均采用Excel 2010和SPSS 19.0软件进行处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 芳樟醇标准曲线及定性分析

以浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归分析，绘制标准曲线见图1，回归方程为Y=42.85X+0.25，相关系数R2=0.999 4，表明在0.2 μg～1.0 μg范围内，芳樟醇峰面积值与进样量的线性关系良好。标准品、样品的色谱图见图2、图3，标准品和样品都在7.2 min出峰且芳樟醇峰和样品中的其他组分均能达到基线分离。

图1 线性关系考察Fig.1 Investigation of linear relation

图2 芳樟醇标准品色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of linalool standard

图3 样品色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of sample

2.1.2 精密度分析

取同一芳樟醇标准品溶液，在1.3.3的色谱条件下，连续重复进样6次，结果见表2。

表2 精密度测定结果Table 2 Results of precision analysis

芳樟醇标准品峰面积的RSD为1.33%（n=6），表明该方法有良好的精密度。

2.1.3 稳定性分析

取同一样品溶液，在1.3.3的色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10 h 进样测定，结果见表3。

表3 稳定性测定结果Table 3 Results of stability analysis

供试品溶液中芳樟醇峰面积的RSD为1.41%（n=6），表明该试验中芳樟醇在放置10 h内稳定性良好。

2.1.4 重复性分析

取1.3.2条件下平行制备的同一样品溶液6份，按1.3.3的色谱条件进行分析检测，结果见表4。

表4 重复性测定结果Table 4 Results of repeatability analysis

供试品溶液中芳樟醇峰面积的RSD为1.30%（n=6），表明该方法重现性优良。

2.1.5 样品加标回收率分析

取加标样品溶液，按1.3.3的色谱条件进行分析检测，结果见表5。

表5 回收率测定结果Table 5 Results of recovery analysis

平均加样回收率为100.25%，RSD=1.40%，表明该方法的加样回收良好，结果可靠，可以用于花生茎叶中芳樟醇含量的测定。

2.2 花生叶中芳樟醇提取条件的优化

2.2.1 单因素试验

粉碎度和料液比对花生叶芳樟醇含量的影响见图4、图5。

图4 粉碎度对花生叶芳樟醇含量的影响Fig.4 Effects of comminution on linalool contents in peanut stems and leaves

由图4可知，当粉碎度为60目～80目时，芳樟醇含量达到最高；当粉碎度在80目以上时，芳樟醇含量明显下降，可能是由于较细的颗粒会因其表面积过大，产生吸附作用，导致其扩散速度下降，溶出率下降[14]。由图5可知，随溶剂用量的增加，芳樟醇含量逐渐增大，当料液比为 1∶100（g/mL）时，含量达到最大值；继续增加溶剂用量，芳樟醇含量趋于平稳，可能由于在一定料液比的条件下，芳樟醇的溶出量达到了饱和，之后则含量基本不再变化[15]。因此，综合考虑选择粉碎度为 60目～80目、料液比为 1∶100（g/mL）。

图5 料液比对花生叶芳樟醇含量的影响Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on linalool contents in peanut stems and leaves

提取温度和提取时间对花生叶芳樟醇含量的影响见图6、图7。

图6 提取温度对花生叶芳樟醇含量的影响Fig.6 Effects of extraction temperature on linalool contents in peanut stems and leaves

图7 提取时间对花生叶芳樟醇含量的影响Fig.7 Effects of extraction time on linalool contents in peanut stems and leaves

由图6可知，在80℃～90℃时，随温度升高，芳樟醇含量快速增加，继续升高温度，芳樟醇含量基本不变，可能与芳樟醇易挥发的性质有关，过高的温度迅速增加了芳樟醇挥发，最终使得溶出与挥发达到动态平衡。由图7可知，在10 min内时，芳樟醇含量随时间的延长增加较缓慢，10 min～20 min，芳樟醇含量迅速增加，20 min以后则芳樟醇含量增加特别缓慢，可能是随时间延长，水温降低，使得溶出速度大大降低。因此，综合考虑选择温度为90℃、提取时间为20 min。

2.2.2 正交试验

正交试验结果及方差分析见表6和表7。

表6 正交试验结果Table 6 The results of orthogonal experiments

表7 正交试验方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test

由表6可知，最优提取条件为A1B2C2D2，即粉碎度40目～60目、料液比 1∶100（g/mL）、提取温度90℃、提取时间20 min。在此条件下验证试验测得花生叶中芳樟醇含量为2.32 mg/kg。由表7可知，料液比和提取温度对花生叶中芳樟醇的提取有显著影响，而提取时间和粉碎度对其提取的影响差异不显著。各提取因素对花生叶中芳樟醇含量提取的影响主次顺序为：料液比＞提取温度＞提取时间＞粉碎度。

2.3 不同时期花生茎、叶中芳樟醇含量的测定

分别取1.3.2条件下制备的初花期、成熟期的花生茎、叶，按1.3.3的色谱条件进行分析检测，平行测定3次，依据测得的峰面积计算芳樟醇的含量，并对其进行统计学分析，结果见表8。

表8 不同时期花生茎、叶中芳樟醇含量Table 8 Linalool contents in peanut stems and leaves at differentperiods

由表8可知，不同时期花生叶中芳樟醇含量均高于花生茎，其中初花期花生叶中芳樟醇含量是茎的4.0倍，成熟期花生叶中芳樟醇含量是茎的3.5倍，且初花期和成熟期花生叶中芳樟醇含量无明显差异。

3 结论

建立一种测定花生茎叶中芳樟醇含量的高效液相色谱法：色谱柱为Venusil XBP C18，流动相为乙腈∶水=1 ∶1，流速 1.0 mL/min，检测波长 205 nm，柱温为30℃，进样量10 μL。并在单因素试验的基础上，通过正交试验确定花生叶中芳樟醇的最佳提取条件：粉碎度40目～60目，料液比1∶100（g/mL），提取温度90℃，提取时间20 min。结果表明：所建立的花生茎叶中芳樟醇的高效液相色谱分析方法具有较好的精密度、稳定性、重现性，平均回收率为100.25%，RSD为1.40%，可作为花生茎叶中芳樟醇的含量的测定。此高效液相色谱法对优化条件下得到的不同时期花生茎、叶中的芳樟醇含量进行测定，不同时期花生叶中芳樟醇含量均高于茎，其中初花期花生叶中芳樟醇含量是茎的4.0倍，成熟期花生叶中芳樟醇含量是茎的3.5倍，并且初花期和成熟期花生叶中芳樟醇含量无明显差异。