石甘散联合托吡酯对癫痫幼鼠认知功能及海马组织CB2R、MDA、SOD水平的影响

杨昕憓，于 滨

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科 150000)

癫痫是一类由已知或未知病因所致的脑部神经元过度同步化放电为特征的发作性脑病。目前医学上关于癫痫的发病机制尚无统一定论[1-2]。已有研究证实，氧化应激所致的后续反应可能在癫痫的发生、发展中扮演着重要角色。氧化应激产物自由基的过度表达可对蛋白质等大分子物质造成损伤，进而破坏细胞结构，引起细胞凋亡[3-5]。因此如何抑制癫痫患者发病或产生的氧化应激反应是治疗癫痫的关键所在。托吡酯为一类广谱抗癫痫药物，已被证实对多种类型癫痫均具有较好的治疗效果，并可作为一线抗痫药物单独或与其他药物联合使用[6-7]。中医药为我国传统医学范畴，其具有毒副作用小、疗效显著等特点，已广泛运用于临床中，而石甘散是有石菖蒲和甘松组成的抗痫药物，临床效果显著[8-9]。基于此，本研究通过探讨石甘散联合托吡酯对癫痫幼鼠认知功能及海马组织大麻素受体2(CB2R)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的影响，旨在为临床上治疗癫痫提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选取60只10日龄SD大鼠，体重为25～35 g，购于河南省实验动物中心[动物许可证：SCXK-(豫)2019-017]。于屏障环境下饲养1周后开始实验，将60只SD大鼠分为对照组、模型组、石甘散组、托吡酯组、联合组，每组12只。

1.1.2主要仪器试剂

托吡酯(西安杨森制药有限公司，国药准字：H20020555，每片25 mg)；石甘散：由石菖蒲、甘松按1∶1比例进行配置；戊四氮、SOD试剂盒、MDA试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；CB2R兔多克隆抗体、兔抗GADPH(武汉博士德生物工程有限公司)；ECL高效化学发光试剂盒(美国Genview公司)；蛋白提取试剂盒(宝生物工程有限公司)。Bio Rad 450酶标仪(美国Bio Rad公司)；JY-SCZ2型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1建模

对照组腹腔注射1 mL的0.9%氯化钠溶液，连续注射28 d。其余4组均于每日固定时间腹腔注射戊四氮溶液(实验前30 min将300 mg戊四氮晶体溶于150 mL的0.9%氯化钠溶液)，连续注射28 d，以RACINE[10]制订的分级法为评断标准，当SD大鼠出现5次级以上Ⅱ级及以上症状即为癫痫模型构建成功。

1.2.2干预

对照组及模型组给予0.9%氯化钠溶液(10 mg/kg)灌胃，每日2次，连续28 d。石甘散组给予1 g/kg石甘散灌胃，每日1次，托吡酯组给予18 mg/kg托吡酯灌胃(使用前，以0.1 mg托吡酯：0.1 mL的0.9%氯化钠溶液比例进行稀释)，每日1次，联合组给予1 g/kg石甘散和18 mg/kg托吡酯灌胃，每日1次，连续干预28 d。

1.2.3认知功能评价

水迷宫实验：水迷宫由直径为1.3 m，高0.5 m的圆形蓄水池及透明玻璃构成，水深0.3 m。实验期间水迷宫周围参照物摆放顺序无变动，水温为室温。在测试前1 d，水池内不放平台，让大鼠于池中自由游泳120 s，让其熟悉周围环境，此阶段持续5 d后开始测试。定位航行实验：放置平台，第1～4天每日上午及下午固定时间按照东北、西北、西南、东南4个象限将大鼠面向池壁完全浸入水中，记录其从入水到找到平台时间。若120 s内未找到平台则引导其找到平台，搜索时间记为120 s。所有大鼠在找到平台后均保持在台上30 s，让其熟悉周围参照物。空间探索时间：第5天撤掉平台，将大鼠头向东北迷宫壁的中点浸入水中，记录大鼠在120 s内穿越原平台次数及在原平台处探索时间，并计算百分比。

1.2.4CB2R、MDA、SOD水平检测

水迷宫实验结束后立即处死大鼠，并提取海马组织。冰浴条件下超声震碎制成10%组织匀浆液，并于4 ℃、3 000 r/min条件下离心10 min,采用考马斯亮蓝检测法测定海马组织MDA及SOD水平。取海马组织，根据蛋白提取试剂盒提取总蛋白并测定浓度。根据Western blot试剂盒说明书进行电泳、转膜、封闭，采用1∶300比例稀释后的兔抗CB2R孵育过夜。次日TBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗，孵育2 h后，进行成像，并采用Image J软件进行灰度值分析。根据内参标准计算目标条带相对值，判断蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 水迷宫结果

第1～4天，5组在同一时间点找到平台时间由高到低分别为模型组、石甘散组、托吡酯组、联合组、对照组。撤掉平台后，穿越原平台位置次数及在平台象限搜索时间所占百分比由低到高分别为模型组、石甘散组、托吡酯组、联合组、对照组，见表1、2。

表1 各组大鼠搜索平台时间

表2 各组大鼠穿越平台时间及在原平台象限搜索时间所占百分比

2.2 脑组织MDA及SOD水平比较

各组MDA水平由高到低分别为模型组、石甘散组、托吡酯组、联合组、对照组，而SOD水平由低到高分别为模型组、石甘散组、托吡酯组、联合组、对照组，见表3。

表3 各组脑组织MDA及SOD水平比较

2.3 海马组织CB2R蛋白水平比较

各组CB2R蛋白水平表现分别为模型组(0.39±0.09)、联合组(0.30±0.06)、石甘散组(0.20±0.05)、托吡酯组(0.19±0.05)、对照组(0.13±0.04)，模型组与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)；石甘散组与对照组及联合组比较差异有统计学意义(P<0.05)；托吡酯组与对照组及联合组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 海马组织CB2R蛋白Western blot结果

3 讨 论

流行病学资料显示，世界范围内癫痫发病率约为5%，且是儿童时期最为常见的慢性神经系统疾病之一，高发于出生后的第一年[11]。大部分癫痫儿童的智力无明显异常，但有部分患儿会表现为暂时或永久性的认知损伤，这将严重影响患儿的生活质量及身心健康。研究认为，导致癫痫患儿认知功能的主要因素包括引起癫痫发作的神经病理因素，其次为癫痫的发作形式、社会心理因素及抗癫痫药物，上述因素相互作用导致患儿的认知功能障碍[12-13]。抗痫药物为目前临床上治疗癫痫的主要方式，其具有应用范围广、使用时间长等特点，而单药或多药物的长期应用导致抗痫药物对患者，特别是大脑处于发育期的患儿认知功能的影响则是临床工作者及家长的关注重点。

托吡酯是一种新型抗痫药物，其发挥作用的主要机制包括以下几个方面[14]：(1)通过γ-氨基丁酸(GABA)受体作用，从而对GABA介导的神经抑制作用产生促进作用；(2)对电压依赖性钠离子通过产生阻断作用；(3)调节谷氨酸水平从而调节离子通道；(4)对部分电压门控及钙门控钾离子通道内流具有增强作用。有研究发现，托吡酯对正常幼鼠的认知功能无影响，而对癫痫幼鼠的认知功能具有一定的改善作用[15]。而也有研究发现，托吡酯对癫痫患者的运动力、注意力等方面产生负面影响[16]。石甘散属我国传统医学范畴，由石菖蒲及甘松组成。研究发现，石甘散可改善戊四氮所致的癫痫大鼠海马组织中的谷氨酸、GABA水平，从而调节离子通道，抑制神经元放电，最终保护脑细胞，发挥抗痫的作用[17]。现代药理学研究表明，石菖蒲含有氨基酸、有机酸、挥发油等成分，具有抗惊厥、镇静、脑保护及益智等作用[18]。而甘松发挥药效的主要成分为甘松新酮，并具有改善认知功能、保护脑神经及镇静等作用[19]。基于此，本研究探讨了石甘散联合托吡酯对癫痫幼鼠认知功能的影响。结果显示，单独用药或联合用药均可改善癫痫幼鼠的认知功能，且石甘散联合托吡酯治疗对幼鼠的认知功能改善效果更为明显。

氧化应激及其所致的神经细胞凋亡是诱发并导致癫痫反复发作的主要原因，其主要机制为活性氧簇ROS的过度表达从而增加了细胞间的钙离子浓度，进而导致脑部神经元的重塑、坏死及凋亡[5]。SOD为机体内超氧化物酶，具有清除自由基、还原有毒过氧化物的作用；MDA是脂质发生氧化应激的终产物，具有细胞毒性，二者在癫痫的发生、发展中均发挥着重要作用。内源性大麻素系统在中枢神经系统中起着重要作用，而CB2R为内源性大麻素受体之一，主要表达于外周免疫细胞。近年来，随着研究的深入，发现CB2R在中枢神经系统中的特定区域也有所表达。有研究发现，在毛果芸香碱诱导的癫痫大鼠模型慢性期中，大麻素可改善大鼠的癫痫行为，并通过对神经元自噬作用激活从而产生抗氧化作用[20]。本研究结果显示，单独用药或联合用药均可改善癫痫幼鼠的脑组织MDA、SOD及海马CB2R水平，且石甘散联合托吡酯治疗对幼鼠的各指标改善效果更为明显，提示可抑制癫痫幼鼠的氧化作用。

综上所述，石甘散联合托吡酯可显著改善癫痫幼鼠认知功能，并提高海马组织SOD活性及CB2R水平，降低MOD含量，抑制氧化反应，减轻自由基对脑组织的损伤。