基于网络药理学探讨玫芦消痤膏治疗痤疮的作用机制*

杨宗发，谈利红，唐 倩

(重庆医药高等专科学校药学院 401331)

痤疮(Acne)是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，其发病与性激素水平、皮脂分泌过多、丙酸痤疮杆菌感染等密切相关，临床表现为粉刺、脓包、丘疹、瘢痕、囊肿等，好发于青春发育期人群[1]。目前临床上常用的治疗药物有抗雄激素、维A酸类、抗生素类等，虽然这些治疗方案是有效的，但存在易耐药、不良反应多等缺点[2]。在古代医学典籍中，痤疮称为肺风粉刺、面疮等，主要有肺经风热、血瘀痰凝、湿热内蕴3种类型[3]。中医药在缓解痤疮临床症状、控制病程等方面具有疗效可靠，复发率低、不良反应少等独特优势。

玫芦消痤膏(MXO)来源于苗族民间验方，全方由库拉索芦荟、苦参、杠板归和大马士革玫瑰组成，具有清热燥湿、活血消斑和杀虫止痒的功效，目前临床上玫芦消痤膏可用于治疗痤疮、湿疹等多种皮肤疾病，且疗效明显[4-5]。大量的循证医学证据已经表明，MXO治疗痤疮具有较好的疗效和安全性，现代药理学研究表明其具有明显抗炎、抗过敏、抑菌、镇痛及止痒等药理作用，但是对于其药理作用机制缺乏全面、系统的阐述[6]。网络药理学区别于传统的“单靶点-单药物-单疾病”研究模式，它可以从系统水平层面研究药物与机体的相互作用，为中药复方的研究提供了一种具有可预测性的新方法[7-8]。因此，本文运用中药网络药理学的方法，挖掘MXO的有效成分、中药靶标、疾病靶标，构建药物-成分-疾病-靶标调控网络，预测MXO治疗痤疮的作用靶标与主要的活性成分，揭示其可能的分子作用靶点和通路。该研究为深入探讨其作用机制和药效物质基础提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 成分筛选及其靶标的获取

本研究是利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索玫芦消痤膏中芦荟、苦参、玫瑰的所有活性成分，杠板归活性成分来源于相关参考文献。药物筛选标准：Lipinski类药5规则，通过上述过程得到玫芦消痤膏的生物活性成分。随后运行Perl软件，获得相关成分的靶点基因，将所得数据去重后录入UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，转化为获取靶点的标准基因名称。

1.2 痤疮疾病相关靶标分析

基于国际疾病靶点数据库OMIM(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“Acne”作为检索词，检索痤疮疾病相关靶点，分值越高，相关证据越多，删减重复后进行归一整合，获得痤疮疾病靶点集。

1.3 活性成分与疾病共同靶点筛选

为了获得痤疮与MXO的共同靶点，运用Rversion3.6.2软件及Perl语言程序将药物靶标基因和疾病基因取交集，结果使用韦恩图(Venn diagram)表示。

1.4 活性成分-疾病-靶点网络构建

利用Cytoscape3.7.1(http://www.cytoscape.org/)软件绘制“活性成分-疾病-靶点”网络图，将整合过后的活性成分和疾病靶点信息导入软件，利用“network analyzer”功能进行网络拓扑学分析。

1.5 蛋白质相互作用(PPI)网络的构建

利用STRING数据库(https://string-db.org/)，构建蛋白互作网络(PPI)，蛋白种类选择“Homo Sapiens”，最低相互作用阈值设置为“medium confidence=0.4”，其他参数保持默认设置，获得PPI网络。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

利用R语言(https://www.r-project.org/)中的BiocManager包对MXO活性成分和痤疮共同靶点进行GO(gene ontology)分析和KEGG(KEGG pathway analysis)通路富集分析，提取P<0.05的通路以及生物过程，并绘制气泡图。

2 结 果

2.1 活性成分的筛选及相应靶标预测结果

通过TCMSP数据库对MXO组成药物已报到的活性成分进行检索，并以设定的ADME参数为条件筛选，去除重复成分后，得到35个核心活性成分，主要包括苦参酚、苦参素、山柰酚、花青素、花生四烯酸、金丝桃苷、芦荟大黄素、槲皮素、木犀草素等。

2.2 MXO-痤疮疾病共同靶标结果

痤疮靶标基因1 312个，MXO药物靶标基因218个，利用Rversion3.6.2软件取交集，得到MXO治疗痤疮的潜在靶点92个，其韦恩图表达见图1。

图1 MXO-痤疮靶标韦恩图

2.3 MXO“活性成分-作用靶标”网络图结果

利用Cytoscape3.7.1软件，构建了MXO“活性成分-作用靶标”网络图，见图2。网络图中紫色圆形节点为作用靶标，绿色椭圆形节点为活性成分，点与点之间的线条代表活性成分与靶标的对应关系。网络中共获得129个节点，其中活性成分35个，作用靶标92个，药物和疾病各1个，还有一些化合物未查询到对应的作用靶标，故未纳入网络图中。

图2 MXO“活性成分-作用靶标”网络图

2.4 MXO蛋白质-PPI网络的构建结果

利用STRING数据库构建了MXO蛋白质-PPI网络图，得到了92种蛋白之间的相互作用关系，见图3。其中节点表示蛋白，每条边表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系。运用R语言插件统计了节点数目排名前30位的蛋白靶点(图4)，相互作用较为密切的蛋白有Rac-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)、白细胞介素(IL)-6、血管内皮生长因子A(VEGFA)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和粒细胞趋化蛋白-1(CXCL8)等，预测可以作为MXO治疗痤疮的潜在靶点。

图3 靶标蛋白相互作用网络图

图4 核心靶标条图(前30位)

2.5 GO功能富集以及KEGG通路富集结果

靶点GO分析柱状图和气泡图见图5、6。纵坐标为生物过程，横坐标和气泡面积大小代表基因数量，气泡颜色代表富集显著性，颜色越红，P值越小，富集的程度越高。从图可知MXO治疗痤疮的生物过程主要涉及核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、细胞因子活性等。KEGG通路富集分析，共得到134条通路，排除广泛通路后，富集靶点数大于10的信号通路见表1。核心靶点主要分布在TNF、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、IL-17、AGE-RAGE等信号通路中。以TNF信号通路为例，MXO治疗痤疮的潜在靶点和作用机制见图7。

图5 GO功能富集分析柱状图

图6 GO功能富集分析气泡图

图中标红的基因是MXO治疗痤疮的潜在靶点。

表1 KEGG信号通路信息

3 讨 论

本研究从中药网络药理学入手，初步分析和探讨了MXO治疗痤疮的作用机制，为MXO活性成分筛选以及多靶点、多通路的治疗机制提供了参考。通过数据库筛选得到MXO的35个活性化合物，根据图2可知，槲皮素、山柰酚、木犀草素、花生四烯酸、β-胡萝卜素、芒柄花黄素、没食子酸和异鼠李素是关键活性成分。研究显示，槲皮素是一种植物源杀菌剂，对多种细菌都有抑制作用，具有较强的体内外抑菌作用与广谱抗菌[9]。此外槲皮素可通过降低炎症因子IL-1、IL-6、IL-10的表达量而达到抗炎症的效果[10]；通过AMPK/Sirt1途径调节炎症因子IL-12和一氧化氮合酶(iNOS)的基因表达量进行抗炎的作用[11]；也可以通过降低特定炎症因子的基因表达来治疗炎症性皮肤病[12]。木犀草素可以通过减少活性氧和活性氮的生成，影响花生四烯酸的代谢和多种炎性信号通路，抑制炎性细胞因子和炎症介质的表达[13]。花生四烯酸能够诱导和抵抗致炎作用、调节神经内分泌和促进细胞分裂[14]。总之，MXO的主要活性成分可通过相关信号通路治疗炎症性皮肤病。

通过对PPI映射网络分析发现，AKT1、IL-6、VEGFA、PTGS2和CXCL8等蛋白具有较大degree值，暗示这些靶点在MXO治疗痤疮的过程中发挥了关键的作用。AKT1在调节NF-κB依赖性基因转录中起重要作用；IL-6涉及多种与炎症相关的疾病状态，它是急性期反应的有效诱导剂；VEGFA基因诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡并诱导血管通透性；PTGS2负责与炎症和有丝分裂有关的类前列腺素的生物合成；CXCL8是炎性反应的主要介质。

GO富集分析明确了共同靶点在治疗中的生物学作用，其过程主要涉及核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、细胞因子活性等。以上生物学过程与痤疮的发病原因机体免疫失衡、炎性因子作用、雄激素作用等都有联系[15]。预测MXO可能是通过调控炎性反应、雌激素水平等生物过程来治疗痤疮，但需要进一步的实验验证。KEGG通路富集分析发现，MXO治疗痤疮主要涉及流体剪切力与动脉粥样硬化通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路等。流体剪切力是血液在血管中流动时对血管壁产生的一种应力，通过影响血管内皮细胞的氧化还原状态等途径，对动脉粥样硬化的进展起着重要作用[16]。虽然流体剪切力与动脉粥样硬化通路中涉及到MXO治疗痤疮的潜在靶点最多，但是目前没有研究表明该通路与痤疮的发生和发展有关。TNF信号通路和IL-17信号通路都是炎症的经典通路，痤疮的本质是一种炎性反应。痤疮与多种炎症因子有关，TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12和IL-1α会促进毛囊口的过度角化及痤疮的特征性炎性损伤[17]。而AGE-RAGE信号通路的激活会增强炎性反应。据报道，激活PI3K/Akt通路，将会导致Fox01转移至胞质内磷酸化失活，并且与雄激素受体解离，从而减少对雄激素受体抑制，进一步增强雄激素受体的作用，诱发痤疮[18]。痤疮的一线治疗药物异维A酸能通过调节PI3K-Akt信号通路，作用于FoxO1，起到治疗痤疮的作用[19]。根据结果推断，MXO的生物活性成分可能通过作用于与炎症、雄激素相关的通路，从而对痤疮起到治疗作用。

综上所述，本研究利用中药网络药理学的方法，在理论上初步探究了MXO治疗痤疮的作用机制，为后续的MXO药理机制分析和实验验证提供了理论支持。