不同直径艾条悬灸改善类风湿性关节炎大鼠 TNF-α、IL-6和IL-2表达的比较

蒋志明,赵丽娜,吴立斌,王敏君,刘磊,胡玲,吴子建

(1.安徽中医药大学,合肥 230012;2.安徽省中医药科学院,合肥 230038)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种未明原因的自身免疫性疾病,以主要关节滑膜炎病变为主。在我国类风湿关节炎的患病率为0.24%～0.5%[1],女性多于男性。作为一种致残率较高且易反复发作性疾病[2],该病预后不良,当前还没有很好的治疗方式。RA属于中医学“痹证”范畴,又称“历节风”“鹤膝风”等,多因先天不足、后天失养至肝脾肾亏虚、正气不足,受风寒湿热之邪侵袭经络而致机体气血不通,关节屈伸不利。

目前,临床针对RA的治疗主要包括非类固醇类药、抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂、基因治疗及造血干细胞移植等[3],但是长期的药物使用会损伤肝肾功能、引起骨髓抑制及胃肠道反应,为患者带来二次伤害[4]。针灸治疗 RA有着良好的效果,且无毒副作用被广泛认可[5]。已有研究[6-7]表明艾灸治疗RA疗效取决于施灸面积和温度,不同的灸温对 RA疗效有着显著差异,45 ℃灸温的条件可以显著提高艾灸的疗效。本实验以课题组前期工作[8]为基础,在控制温度(45±1) ℃条件下,通过观察不同直径艾条悬灸对RA模型大鼠关节状态和血清肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukine,IL)-6和白细胞介素(interleukine,IL)-2浓度的影响,探讨不同直径艾条的施灸面积在治疗RA疗效方面的差异,为艾灸治疗RA的动物实验研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康成年雄性SD大鼠48只,体质量(170±10) g,购自安徽省实验动物中心,许可证号为 SCXK(皖)2017-001。所购大鼠在动物房适应性饲养1周后,随机进行分组。除正常组外,其余大鼠进行RA造模,成功后随机分为模型组、0.5 cm直径艾条悬灸组(0.5 cm组)、0.9 cm直径艾条悬灸组(0.9 cm组)、1.2 cm直径艾条悬灸组(1.2 cm组)、1.8 cm直径艾条悬灸组(1.8 cm组)。实验大鼠均采用独立送风隔离笼具饲养,每笼 4只,室温为(27±1) ℃,湿度(55±5)%,每日更换垫料、补充饲料及饮用水。实验过程严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》[9]。

1.2 主要试剂与仪器

IL-2、IL-6、TNF-α ELISA检测试剂盒(武汉基因美科技有限公司,货号 JYM0648Ra,JYM0646Ra,JYM0635Ra);完全弗氏佐剂(Sigma,SLBW7430);苏木素染色液(Baso,货号 BA-4041);中性树胶(国药,货号 10004160);伊红染色液(Baso,货号BA-4022);5年陈纯艾绒条(湘香艾生物科技有限公司,Q/JXFF001-2015);非接触式红外测温仪(优德利科技有限公司,型号 UT302A),酶标仪(雷社,型号 T-6000),光学显微镜(日本 OLYMPUS,型号 BX53),离心机(安徽嘉文,型号JW3021HR),切片机(Leica公司,RM2016),漩涡混合器(其林贝尔仪器制造公司,型号 GL-88B),生物组织包埋机(湖北亚光,型号 YB-7LF);电热恒温箱(上海三发科学仪器有限公司,DNP-9162AE)。

1.3 模型制备与鉴定

采用模拟自然风、寒、湿环境与生物因子弗氏完全佐剂(CFA)结合造模[10],将鼠笼置于自制造模箱内,应用超声雾化器调控箱内湿度,并在箱内添加适量冰块,使其环境湿度、温度分别维持在 80%～90%、(6±2) ℃,风力定于高档,时间持续12 h。所有需要造模的大鼠均放入上述风、寒、湿环境中20 d(12 h/d)。第21天用0.5%碘伏消毒大鼠右后足跖关节部位,注射完全弗氏佐剂溶液0.15 mL致炎,建立RA大鼠模型。随后对大鼠进行为期3 d的观察,以24 h大鼠足踝部出现急性炎症肿胀,48 h后前肢或对侧肢体甚至耳、尾部红肿或炎性结节为造模成功,此间共23 d。

1.4 干预方法

课题组前期实验研究[8]表明,在实验艾条中选取市面相应的艾条规格直径分别为(0.5 cm、0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm),施灸距离(小于1 cm、1～2 cm、2～3 cm、3～5 cm)可以实现穴区表面温度为(45±1) ℃。参考《实验针灸学》[11]中动物穴位图谱大鼠右下肢足三里穴区作为施灸穴位。

实验中各组大鼠做同样抓取,并放置在悬空木架上,正常组、模型组不做干预,各艾条悬灸组用5年陈艾条在距离大鼠足三里穴区进行悬灸,并根据大鼠的避让适时地调整施灸距离,使用红外测温仪监控穴区表面温度,控制在(45±1) ℃,每日1次,每次20 min,连续干预15 d。

1.5 样本处理

在连续干预 15 d后,检测大鼠足跖容积,称重后10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉。暴露腹腔,腹主动脉处采血2 mL,放置4 ℃冰箱20 min后,在低温离心机离心5 min,3 000 r/min,取其上清液。将取血后大鼠移至超净工作台,在冰上剪开大鼠膝关节皮肤,暴露膝关节,沿髌骨向下使用镊子完全分离呈浅淡黄色的滑膜组织,取下右后肢滑膜组织后固定在4%多聚甲醛中。

1.6 指标检测

1.6.1 关节肿胀度测量

在致炎前1 d、致炎后3 d及15 d对大鼠进行足跖容积测量,通过足跖容积测量仪测量各组大鼠右后肢足跖容积。用记号笔在大鼠足踝关节处标记划线,固定住大鼠右后膝关节处使其后足伸直,缓慢放入测量杯内,当测量杯水平面与鼠足上的测量标线重叠时,启动测量开关并读取测量数据,计算大鼠足跖肿胀度[12]。

1.6.2 组织病理学观察

将取下的各组大鼠部分关节固定在 4%多聚甲醛中进行石蜡包埋,切片进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,经过烤片和脱蜡、水化、苏木素染色、伊红染色、透明和封片,后在光学显微镜下进行观测拍照,观察大鼠右后肢关节滑膜常规病理变化,并在高倍镜下利用直尺对大鼠右后肢关节滑膜厚度进行测量统计。

1.6.3 血清IL-6、IL-2和TNF-α水平检测

大鼠全血离心后取上清液,采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定各组大鼠血清 IL-6、IL-2和TNF-α含量,按试剂盒说明书中的步骤进行标准品制备、加样、抗体孵育等操作,加入终止液后酶标仪在450 nm波长下检测每孔吸光度值(OD值)。绘出标准曲线和标准方程,将每孔OD值代入标准方程求出每个样本的浓度。

1.7 统计学方法

采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,重复测量资料比较选用重复测量方差分析,根据球形检验结果采用 Sphericity Assumed法分析组间差异,后选用Bonferroni法进行两两比较。多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法,若方差不齐者采用Games-Howell法;若不符合正态分布,采用 Cruskal Wallis秩和检验进行分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及不同直径艾条灸足三里穴位穴区温度的观察

在模拟(风、寒、湿)环境对大鼠进行20 d饲养后各造模大鼠饮食量减少、精神不振、皮毛光泽度下降,注射弗氏完全佐剂后次日观察到模型大鼠右足跖部肿胀明显呈红紫色,注射弗氏完全佐剂 3 d各造模组大鼠关节肿胀蔓延至踝部关节,伴有步态改变、活动障碍,随后对模型大鼠随机分组进行艾灸治疗,通过调整不同直径艾条施灸距离以保持穴区表面温度在(45±1) ℃。详见图1。

图1 不同直径艾条灸足三里穴位穴区的观察

2.2 各组大鼠足跖容积比较

结果显示造模前1 d各组大鼠足跖容积比较差异无统计学意义(P＞0.05)。致炎后3 d,与正常组比较,模型组、0.5 cm组、0.9 cm组、1.2 cm组、1.8 cm组大鼠足跖与踝部急剧红肿,足跖容积明显增粗,提示造模成功(P＜0.01),模型组与各艾灸组大鼠之间足跖容积差异无统计学意义(P＞0.05),表明在此造模条件下各组有可比性。在致炎后15 d,与模型组比较,各艾灸组大鼠足跖容积明显减小(P＜0.01),其中 1.8 cm组效果最佳,低于 0.5 cm组(P＜0.05);而0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠足跖容积比较 (±s,mL)

表1 各组大鼠足跖容积比较 (±s,mL)

注:与正常组比较1)P＜0.01,2)P＜0.05;与模型组比较3)P＜0.01;与0.5 cm组比较4)P＜0.05

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2.3 各组大鼠右后肢滑膜组织病理变化比较

组织病理学染色显示正常组大鼠关节中滑膜细胞多呈单层且细胞分布整齐有规则,滑膜组织无炎性浸润。模型组大鼠滑膜表面粗糙且增生严重,滑膜细胞排列紊乱无规则,滑膜组织中有大量炎性细胞浸润。详见图2。

图2 各组大鼠关节滑膜组织病理比较(HE,×200)

与正常组比较,模型组滑膜厚度增加差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较,0.5 cm、0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm组滑膜组织炎性浸润与滑膜增生情况均有改善(P＜0.01);0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm组较0.5 cm组滑膜增生情况改善明显(P＜0.01)。详见表2。

表2 各组滑膜厚度量化比较 (±s,cm)

表2 各组滑膜厚度量化比较 (±s,cm)

注:与正常组比较 1)P＜0.01;模型组比较 2)P＜0.01;与0.5 cm组比较3)P＜0.01

组别 n 大鼠滑膜厚度正常组 8 0.065±0.1502)3)模型组 8 1.088±0.1951)0.5 cm组 8 0.600±0.1001)0.9 cm组 8 0.110±0.0.0201)2)3)1.2 cm组 8 0.082±0.0071)2)3)1.8 cm组 8 0.070±0.0081)2)3)

2.4 各组大鼠血清IL-6、IL-2、和TNF-α含量比较

与正常组比较,模型组血清中IL-6、TNF-α含量升高,IL-2含量下降,差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较,各艾灸组治疗后 IL-6、TNF-α含量下降,IL-2含量升高,差异具有统计学意义(P＜0.01)。与0.5 cm组比较,0.9 cm组、1.2 cm组、1.8 cm组TNF-α、IL-6含量降低(P＜0.01),IL-2含量均有所上升(P＜0.01)。详见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6、IL-2、和TNF-α含量比较 (±s,pg/mL)

表3 各组大鼠血清IL-6、IL-2、和TNF-α含量比较 (±s,pg/mL)

注:与正常组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01;与0.5 cm组比较3)P＜0.01

组别 n IL-2 IL-6 TNF-α正常组 6 90.305±1.130 12.417±1.024 60.691±1.247模型组 6 51.181±0.6771) 29.248±1.4571) 93.122±2.2651)0.5 cm 组 6 59.911±1.5021)2) 25.258±0.0861)2) 71.872±1.7781)2)0.9 cm 组 6 68.841±2.9771)2)3) 19.912±0.9611)2)3) 67.096±1.4281)2)3)1.2 cm 组 6 69.853±1.2961)2)3) 19.900±1.1721)2)3) 67.363±2.2841)2)3)1.8 cm 组 6 70.851±1.0071)2)3) 19.753±0.6141)2)3) 67.699±2.0501)2)3)

3 讨论

中医学认为类风湿关节炎(RA)多因先天不足、后天失养,而致肝脾肾不足、气血亏虚,而又复感风寒湿邪,湿、热、瘀相互蕴结,阻于经脉,使得机体肌肉、筋骨不得温养,致使关节痹阻、屈伸不利,出现疼痛、活动不利等症状。本实验采取“病证”结合方式,通过模拟自然风、寒、湿环境,结合CFA造模,符合中医证候的特点,结果满意。有研究表明艾灸疗法有抗炎、镇痛、提高机体免疫力的功效,对 RA治疗有着良好的效果[13-15]。其作用机制主要与艾灸过程中光、热、烟及生成物对机体表皮穴位刺激有关,其中光、热刺激被认为是最主要的效应因素[16-18],在治疗过程中艾灸疗效的发挥还与施灸的方法、灸量的多少、穴位的功效有关[19-21]。朱兵[22]证实了艾灸疗效的发挥主要取决于施灸温度、光热辐射面积。喻晓春等[23]科学诠释了腧穴的动态观念,体表腧穴大小和功能强弱是随着机体内脏功能转变而变化的。笔者认为在艾灸过程中要根据患者的个人情况发挥艾灸效应的最大化,故要根据不同患者情况选择合适规格直径的艾条,然而在对于实验与临床中关于艾条的直径规格及对腧穴施灸过程中的距离、温度、艾灸光热辐射面积没有统一的标准。有研究表明当灸温达到45 ℃时可以提高艾灸疗效[7]。课题组前期实验证实[8]使用不同直径艾条在距离大鼠足三里穴区悬灸,可通过调节艾条与穴区的距离使灸温达到45 ℃。本实验在不烫伤大鼠条件下,通过适当调整施灸距离以控制穴区表面温度在(45±1) ℃,观察不同直径艾条施灸对RA大鼠的影响,进而为探讨艾灸疗效与艾条灸辐射范围的关系提供初步的实验支持,为实验中不同直径艾条规格的选取等进行探索。

实验中经过造模后大鼠急性炎症红肿、活动不便。通过艾条悬灸治疗后,观察到大鼠的一般情况、足跖肿胀程度、活动都有明显的好转。说明艾灸大鼠足三里穴区对RA大鼠具有一定的治疗作用。通过对比各组足跖容积变化,发现0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm较0.5 cm组大鼠足跖容积均有所下降,1.8 cm组RA大鼠足跖容积下降较0.5 cm组更为明显,说明1.8 cm直径的艾条在减轻RA大鼠足跖肿胀度方面更优。

在病理形态改变上,RA大鼠关节滑膜增生及血管翳的形成,使关节软骨与关节滑液的正常接触被阻断,影响骨质营养的吸收,并进一步破坏软骨及韧带造成关节腔的功能性损伤[24]。在经过艾灸治疗后各艾灸组RA大鼠滑膜增生、炎症反应情况均有所改善。而0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm组大鼠在经过治疗后滑膜增生较0.5 cm组大鼠改善较为明显。

RA大鼠足跖肿胀度与其炎性反应及大鼠关节滑膜增生有相关性[25],在RA进程中免疫细胞及其分泌的细胞因子参与炎症反应[26-27],其中TNF-α、IL-6、IL-2在RA发病机制中发挥重要的作用[28-29]。有研究表明在RA患者血清中TNF-α、IL-6含量升高,IL-2含量下降,经过有效治疗后TNF-α、IL-6含量下降、IL-2含量上升[30]。本实验表明,经过造模后RA大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α含量升高,IL-2含量减少,提示 RA大鼠免疫功能受损,全身炎性因子网络平衡被打破[31-32],与临床研究结果一致。通过15 d艾灸干预后各艾灸组较模型组 IL-6、TNF-α含量均有所降低,IL-2含量升高。在0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm组大鼠血清中IL-6、TNF-α较0.5 cm组含量显著下降,IL-2均上升明显。说明0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm直径艾条在抗炎方面要优于0.5 cm艾条。

由此可以说明,在不烫伤大鼠情况下,使用直径0.5 cm、0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm艾条,并适当调节各组施灸距离使灸温控制在(45±1) ℃,可以显著减轻大鼠足跖肿胀程度及滑膜增生,减低血清中 IL-6、TNF-α的含量,增加IL-2的含量,在抗炎、抑制滑膜增生等方面有着明显的疗效;而直径0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm艾条在抗炎及抑制滑膜增生效果要明显优于0.5 cm直径艾条。

本实验初步研究了在相同穴区温度条件下,悬灸的艾条直径与艾灸疗效之间的关系,为今后艾灸动物实验中施灸艾条规格的选择和临床艾灸标准化提供了一定的参数意义。在实验中存在着不可避免的人为因素和对不同直径艾条在施灸过程中灸火在 RA大鼠体表穴区面积、温度辐射等参数的观察方面的不足,对实验结果有一定的影响,需在今后实验中进行改进,以期得到更为标准化的艾灸方法。