下肢动脉硬化闭塞症患者血浆微RNA-377-3p水平及与支架内再狭窄的关系

邹仁亮

(南阳医学高等专科学校附属第一医院，河南 南阳 473000)

下肢动脉硬化闭塞症(lower extremity arteriosclerosis obliterans，LASO)是一种因下肢动脉粥样硬化斑块形成，堵塞血管，导致肢体慢性缺血、缺氧的疾病[1]。目前，关于LASO的发病机制尚未完全阐明，多认为与高血压、糖尿病、高脂血症等诱发的血管内皮损伤等有关[2]。支架植入术作为LASO的治疗方式之一，可有效改善肢体血流阻塞导致的缺血、缺氧状态，但随时间进展，部分患者会发生支架内再狭窄，严重降低生活质量[3]。探讨LASO患者术后支架内再狭窄的预测因子有着重要临床意义。微核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类由18～22个核苷酸组成的单链RNA，部分miRNA已被证实参与了支架内再狭窄过程，如miR-223[4]、miR-21[5]和miR-31[6]等，但少有研究分析miR-377-3p与支架内再狭窄的关系。目前，已有研究[7]证实miR-377-3p可调控动脉粥样硬化相关的血管平滑肌细胞的增殖和迁移，血管平滑肌细胞的增殖和迁移与支架内再狭窄的发生关系密切[8]，因此，有理由推测miR-377-3p与支架内再狭窄有关。本研究通过分析miR-377-3p与支架内再狭窄的关系，以期为LASO术后支架内再狭窄的预防和治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2016年2月至2019年8月就诊的115例LASO患者作为研究对象。LASO诊断参考《下肢动脉硬化闭塞症诊治指南》，有明显的症状及体征，踝肱指数<0.9，经CT血管造影检查确诊为LASO。纳入标准：(1)首次诊断为LASO；(2)治疗方案为支架植入术，术后常规服用抗血小板聚集药物；(3)签署了知情同意书。排除标准：(1)有支架植入术禁忌症；(2)伴大动脉炎、骨关节炎、糖尿病肾病、急性肺损伤或恶性肿瘤等；(3)临床资料不完整；(4)未定期复查。本研究经南阳医学高等专科学校附属第一医院医学伦理委员会批准。

1.2 临床信息采集采集入组患者年龄、性别、体质量指数(body mass index，BMI)、糖尿病史、高血压史、高脂血症史、血管闭塞位置、闭塞支数、闭塞长度、闭塞程度、C反应蛋白(C reactive proteins，CRP)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)等信息。出院后每6个月复诊1次，行CT血管造影检查了解术后1年内有无支架内再狭窄(支架内和支架两端5 mm内血管腔狭窄程度大于50%[9])发生。

1.3 miR-377-3p水平检测用实时荧光定量PCR法[10]检测miR-377-3p水平。抽取入组患者入院当天和术后12 h内肘部静脉血10 mL，离心后取上清液，将其置于-80℃冰箱中保存，待验。用TRIzol试剂提取血浆中总RNA，然后用逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)将RNA逆转录为cDNA，最后用A100型PCR仪(山东博科科学仪器有限公司)扩增cDNA，扩增反应条件为93 ℃ 5 min,93 ℃ 15 s,65 ℃ 30 s,70 ℃ 30 s,35个循环。miR-377-3p序列F：5′-ATCACACAAAGGCAACTTTTGT-3′；R：5′-GGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；内参U19序列F：5′-TGGAGTTGATCCTAGTCTGG-3′；R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。用2-△△Ct法计算miR-377-3p水平。

1.4 统计学处理用SPSS 19.0软件进行统计学处理。正态性的计量资料用“均数±标准差”表示，两组间比较用独立样本t检验；组间比较用配对样本t检验。计数资料用率[n(%)]表示，组间比较用卡方检验。用ROC分析miR-377-3p评价支架内再狭窄的价值。用Logistic回归分析LASO术后支架内再狭窄的风险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LASO患者临床特征115例LASO患者年龄37～78(58.85±7.91)岁，男性75例，女性40例，BMI(23.95±2.75)kg/m2；有高血压史93例，糖尿病史45例，高脂血症史73例；FBG(6.59±1.06)mmol/L，TC(4.56±1.11)mmol/L，TG(1.98±0.34)mmol/L，LDL-C(3.48±0.78)mmol/L，HDL-C(1.11±0.20)mmol/L，CRP(9.17±3.11)mg/L；髂-股动脉段病变48例，腘动脉及远端病变67例；单肢病变90例，双肢病变25例；完全闭塞34例；血管病变长度(7.02±2.12)cm。115例LASO患者中有44例(38.26%)术后1年内发生支架内再狭窄。

2.2 两组临床特征比较根据术后1年内是否发生支架内再狭窄将115例LASO患者分为再狭窄组(n=44)和未狭窄组(n=71)。两组在年龄、性别、BMI、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、FBG、TC、TG、HDL-C、病变位置方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。再狭窄组的LDL-C、CRP、双肢病变占比、完全闭塞占比和病变长度均高于未狭窄组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组临床特征比较

2.3 两组miR-377-3p水平比较2组的miR-377-3p水平差异有统计学意义(F=40.893，P<0.001)，再狭窄组术后的miR-377-3p水平低于未狭窄组，差异有统计学意义(P<0.05)；术前和术后的miR-377-3p水平差异有统计学意义(F=503.632，P<0.001)，2组术后的miR-377-3p水平均高于术前，差异均有统计学意义(P<0.05)；时间和支架内再狭窄之间存在交互效应(F=59.597，P<0.001)，再狭窄组的miR-377-3p水平升高程度低于未狭窄组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组miR-377-3p水平比较

2.4 miR-377-3p评价支架内再狭窄的价值术前miR-377-3p评价支架内再狭窄的ROC曲线下面积、最佳截断点、敏感度和特异度分别为0.548(95%CI：0.442～0.655)、0.69、52.27%和60.56%；术后miR-377-3p评价支架内再狭窄的ROC曲线下面积、最佳截断点、敏感度和特异度分别为0.888(95%CI：0.831～0.944)、1.14、88.64%和71.83%。术后miR-377-3p评价支架内再狭窄的ROC曲线下面积大于术前miR-377-3p，差异有统计学意义(Z=5.494，P<0.001)，见图1。

图1 miR-377-3p评价支架内再狭窄的ROC曲线

2.5 LASO术后支架内再狭窄的Logistic回归分析

将是否发生支架内再狭窄作为因变量，将LDL-C、CRP、病变肢数、完全闭塞、病变长度和术后miR-377-3p作为自变量，纳入Logistic回归分析，结果显示LDL-C、CRP、双肢病变、病变长度是支架内再狭窄的独立危险因素(P<0.05)，术后miR-377-3p是支架内再狭窄的独立保护因素(P<0.05)，见表3。

表3 LASO术后支架内再狭窄的Logistic回归分析

3 讨论

支架植入术后再狭窄严重影响了LASO患者的预后，也是亟需解决的难题。探究预示支架内再狭窄的生物标志物有着重大临床意义。目前，有研究[11]表明LASO患者支架植入术后1年内再狭窄率高达40%～60%，本研究中LASO患者术后1年内支架内再狭窄率为38.26%，与既往报道结果接近。本研究主要就miR-377-3p与支架内再狭窄的关系进行探讨。

本研究比较了再狭窄组和未狭窄组的术前和术后miR-377-3p水平，结果显示两组术后miR-377-3p水平均升高，但未狭窄组的miR-377-3p水平高于再狭窄组，上述结果提示miR-377-3p与支架内再狭窄有关，其水平或可成为潜在的支架内再狭窄的生物标志物。为进一步分析miR-377-3p与支架内再狭窄的关系，本研究构建了miR-377-3p评价支架内再狭窄的ROC曲线，结果显示术后miR-377-3p评价支架内再狭窄的ROC曲线下面积、敏感度和特异度分别为0.888、88.64%和71.83%，其价值高于术前miR-377-3p，上述结果表明术后miR-377-3p对支架内再狭窄有一定预示效果，但特异度偏低，尚可辅助用于评价支架内再狭窄。

既往研究[12-15]结果显示糖尿病、高血压、血管病变长度、完全闭塞、LDL-C等是LASO患者术后1年内支架内再狭窄的危险因素。本研究为避免混杂因素影响分析结果，采用Logistic回归分析LASO患者术后1年内支架内再狭窄的风险因素，结果显示LDL-C、CRP、双肢病变、病变长度是支架内再狭窄的独立危险因素，糖尿病、高血压和完全闭塞与LASO患者术后1年内支架内再狭窄无关，推测其原因与样本量大小和地域等因素有关，后续将开展大样本、多中心研究进行验证。此外，本研究结果还显示术后miR-377-3p是支架内再狭窄的独立保护因素。血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移可促使动脉粥样硬化的发生，加速斑块形成，堵塞血管。miR-377-3p过表达可靶向神经纤维蛋白2抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移[7]，其水平反映了抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移的程度，由此，miR-377-3p水平高，LASO患者术后1年内支架内再狭窄的风险低。

综上所述，LASO患者支架植入术后miR-377-3p水平升高，其水平与1年内支架内再狭窄有关。术后miR-377-3p水平低提示1年内支架内再狭窄风险高。本研究尚存在一定不足，仅分析了术后12 h内miR-377-3p水平与支架内再狭窄的关系，尚不能确定其是最佳的评价支架内再狭窄的指标，后续将观察其动态水平，并分析与支架内再狭窄的关系，以弥补本研究的不足。