基于自噬基因Atg5和Beclin1探讨益气活血方对大鼠心肌缺血损伤的保护作用

顾媛媛，陈 媚，王连芝，张淑香，尚艳琦，梁 慧，周忠光

（黑龙江中医药大学 中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040）

缺血性心血管疾病是临床上常见病、多发病，心肌组织缺血后，会发生一定程度的损伤甚至死亡，严重威胁着人类的健康。随着对缺血性心血管疾病病因、发病机制的深入研究，最近的研究数据表明自噬在缺血性心血管疾病发病机制中起重要作用[1]。自噬是近年来生命科学研究的热点，是一种组成型活跃的、进化保守的生理性自我降解过程[2]，有望成为缺血性心血管疾病中一种新的治疗靶点。

关于益气活血方或益气活血法在临床研究中有很多，多用于慢性心力衰竭、心绞痛、心肌梗死、冠心病等症的治疗[3-5]。本实验中所用的益气活血方剂是由当归、川芎、地龙、三七、红花、山楂等11味中药组成，是在脑得生的基础上进行加减配伍而成，多年临床实践表明具有益气活血、化瘀通络等功效[6-7]。本课题组前期实验发现其对心肌缺血也有一定的保护作用，但研究尚未深入，作用机制也不清楚，因此，本实验拟通过建立大鼠急性心肌缺血损伤模型，观察益气活血方对心肌缺血损伤的保护作用并探讨其自噬相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药品与试剂 益气活血方由川芎、当归、三七等11 味中药材经提纯制得，地奥心血康（批号：1709054，成都地奥制药集团有限公司）；异丙肾上腺素（美国Sigma-Aldrich公司）；10%水合氯醛（天津市福晨化学试剂厂）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（北京索莱宝科技有限公司）；2.5%戊二醛电镜固定液[北京雷根（Leagene）生物技术有限公司]；Trizol试剂（北京天根生化科技有限公司）；PCR反应试剂盒（批号：DRR037，大连宝生物公司）；SYBR PrimeScript RTPCR试剂盒（批号：DRR041，大连宝生物公司）。

1.1.2实验动物 SD健康大鼠60只，雄性，体质量为220～250 g。由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供，许可证号：SCXK（黑）2013-004。

1.1.3主要仪器 902-ULTS型超低温冰箱（美国Thermo公司）；KDC-160R型高速冰冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；HITACHI H-7650型透射电镜（日本日立公司）；7500型荧光定量PCR（美国ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1分组、给药及模型制备 将60只SD大鼠随机分成空白组、模型组、地奥心血康组（54 mg/kg）、益气活血方高、中、低剂量组（2.916、1.458、0.729 g/kg），每组10只，连续灌胃给药14 d，1次/d。利用腹腔注射异丙肾上腺素（5 mg/kg，1次/d，连续3 d）对大鼠进行给药造模[8-9]。

1.2.2心肌梗死面积的测定 取缺血24 h后的大鼠心脏，用生理盐水冲洗干净，用保鲜膜包裹后放入-20 ℃下冷冻1 h。取出后自心尖向心底横切制作成约1.2 mm的组织切片，浸入1% TTC磷酸盐缓冲液中，于37 ℃避光孵育15 min。正常心肌组织将呈现红色，梗死的心肌组织呈现苍白色[10]。采用数码相机拍照采集图像，用Image ProPlus 6.0软件分析处理图像并计算心肌梗死面积。

1.2.3透射电镜观察对心肌细胞超微结构影响取大鼠心肌组织，用生理盐水冲洗干净，修剪成大小约为1 mm3。置于2.5%戊二醛电镜固定液中固定，并于4 ℃保存，送哈尔滨医科大学电镜中心行透射电镜检查，观察各组心肌细胞超微结构的变化。

1.2.4Atg5、Beclin1、Caspase-3 mRNA的 表 达

取缺血区心肌组织，使用Trizol试剂提取组织总RNA，分光光度计法检测RNA的纯度，参照反转录试剂盒说明反转录成cDNA进行PCR扩增（扩增引物由上海生工公司合成，序列见表1）。PCR反应条件为：预变性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环，同时在60 ～ 95 ℃进行溶解曲线分析。以GAPDH为内参基因，每个样本重复检测3个孔，记录CT值，结果采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。

表1 PCR 引物序列Tab. 1 PCR primer sequence

1.2.5统计学方法 用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料用均数 ± 标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对心肌梗死面积的影响

空白组大鼠心肌染色正常，几乎未见无梗死；与空白组比较，模型组梗死面积增多（P＜0.01），表明心肌梗死程度严重；与模型组比较，地奥心血康组，益气活血方各剂量组均能减少心肌梗死面积（P＜0. 01），减轻心肌梗死程度。提示益气活血方对大鼠心肌缺血损伤有保护作用，具体见表2。

表2 对急性心肌缺血模型大鼠心肌梗死面积的影响（± s，n ＝ 6）Tab. 2 Effects on the area of myocardial infarction in rats acute myocardial ischemia（± s，n ＝ 6）

表2 对急性心肌缺血模型大鼠心肌梗死面积的影响（± s，n ＝ 6）Tab. 2 Effects on the area of myocardial infarction in rats acute myocardial ischemia（± s，n ＝ 6）

注：与空白组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.05，4）P＜0. 01（下表同）

组别 心肌梗死面积/%空白组 0模型组 46.43 ± 2.632）地奥心血康组 22.96 ±1.744）益气活血方高剂量组 23.65 ±1.824）益气活血方中剂量组 28.23 ±1.574）益气活血方低剂量组 33.27 ±1.634）F 8.571 P 0.000

2.2 透射电镜观察对心肌细胞超微结构影响

空白组心肌细胞核及染色质分布均匀，肌纤维肌丝排列致密，闰盘结构规则清晰，线粒体脊清晰可见。模型组心肌细胞凋亡，染色质聚集，肌丝疏松断裂，闰盘开裂，线粒体肿胀，与心肌肌丝之间有空泡，心肌细胞核肿胀。益气活血方低剂量组线粒体局灶变性，糖原增多，堆积，说明线粒体利用糖原的能力下降；心肌细胞核正常，闰盘、线粒体变形，糖原堆积。益气活血方中、高剂量组和地奥心血康组心肌超微结构均有不同程度的改善，线粒体排列较为规则，呈圆形或椭圆形，肌丝疏松，排列整齐，线粒体完好；闰盘较完整，心肌细胞核正常，以益气活血方高剂量组最为显著。说明益气活血方能够明显改善心肌超微结构，且高剂量组改善程度最为明显，具体见图1。

图1 各组大鼠心肌组织的超微结构Fig.1 Ultrastructure of myocardial tissue in each group of rats

2.3 PCR法检测各组大鼠心肌组织中Atg5、Beclin 1、Caspase-3基因表达

结果表明，与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中Atg5、Beclin 1 mRNA的相对表达量均降低（P＜0.01），Caspase-3 mRNA的相对表达量均升高（P＜0.01）；与模型组比较，地奥心血康组和益气活血方高、中、低剂量组大鼠心肌组织中Atg5、Beclin 1 mRNA的相对表达量均升高（P＜0.01或P＜0.05），Caspase-3 mRNA的相对表达量均降低（P＜0.01或P＜0.05），具体见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中Atg5、Beclin1、Caspase-3 mRNA 相对表达量的检测结果（± s，n ＝ 6）Tab. 3 The detection results of the relative expression of Atg5, Beclin1 and Caspase-3 mRNA in the myocardial tissue of each group of rats（± s，n ＝ 6）

表3 各组大鼠心肌组织中Atg5、Beclin1、Caspase-3 mRNA 相对表达量的检测结果（± s，n ＝ 6）Tab. 3 The detection results of the relative expression of Atg5, Beclin1 and Caspase-3 mRNA in the myocardial tissue of each group of rats（± s，n ＝ 6）

组别 Atg5 Beclin l Caspase-3空白组 4.159 2 ± 0.238 5 0.019 4 ± 0.002 3 0.887 6 ± 0.095 2模型组 0.685 7 ± 0.0892 2） 0.003 3 ± 0.0072） 5.064 6 ± 0.375 92）地奥心血康组3.080 5 ± 0.312 24） 0.016 9 ± 0.002 54） 1.879 6 ± 0.087 64）2.738 1 ± 0.265 44） 0.013 5 ± 0.001 84） 2.650 9 ± 0.214 24）2.027 3 ± 0.311 74） 0.010 8 ± 0.002 24） 3.817 2 ± 0.179 24）1.350 2 ± 0.089 13） 0.007 1 ± 0.001 23） 4.259 1 ± 0.294 2益气活血方高剂量组益气活血方中剂量组益气活血方低剂量组F 11.292 9.136 6.438 P 0.000 0.000 0.002

3 讨论

自噬相关基因参与自噬的调节，Atg5是参与细胞自噬性死亡的重要蛋白，与Atg12、Atg16形成复合物，参与自噬体的形成，最终使膜聚集以形成新的自噬体[11-12]。Beclin1是自噬起始阶段的关键调控分子之一[13]，最初是由LIANG X H等[14]在研究致死性Sinbis病毒性脑炎的大鼠体内发现的，是第一个被鉴定出的哺乳动物自噬相关基因。Beclin1与PI3KC3结合，参与自噬体的形成，下调细胞的自噬活性。而Caspase-3是细胞凋亡过程中的一个关键酶。

本研究通过给大鼠腹腔注射异丙肾上腺素制备急性心肌缺血模型，观察益气活血方对心肌缺血模型大鼠的药效学作用，同时探索益气活血方在防治心肌缺血可能的作用机制及其靶点。结果发现，与模型组比较，地奥心血康组和益气活血方各剂量组心肌细胞的超微结构以及心肌梗死面积等均有较大的改善，说明益气活血方对大鼠急性心肌缺血具有一定的防治效果。在确定疗效的基础上，我们对益气活血方预防大鼠急性心肌缺血的自噬作用机制进行了初步的研究，结果发现益气活血方高、中、低剂量组大鼠心肌组织中Atg5、Beclin 1 mRNA的相对表达量均显著提高，Caspase-3mRNA的相对表达量均显著降低。说明益气活血方对心肌缺血引起的心肌损伤具有预防作用，其作用机制可能通过自噬途径下调Caspase-3表达有关。

由于自噬的调控机制尚未完全阐明，以及自噬与缺血性心血管疾病关系的复杂多样，至今关于自噬在疾病发生与发展中的作用及其分子机制的研究尚处于初级研究阶段，随着研究的深入，有望为以自噬为靶标的缺血性心血管疾病的诊断治疗和药物研发奠定基础。

4 结论

本研究探讨益气活血方对大鼠心肌缺血损伤的保护作用及其作用机制，结果显示，益气活血方能够明显减轻心肌缺血模型大鼠心肌梗死程度，改善心肌超微结构。说明益气活血方对大鼠急性心肌缺血具有一定的保护作用，其作用机制可能是通过自噬途径实现的。但由于中药复方成分及作用机制复杂，对于更深入的作用机制有待于进一步探究。