无创粪便SDC2甲基化联合血清CEA在结直肠癌早期诊断中的应用价值

李 锦，孙 珍

[1.深圳市宝安区中心医院消化内科(深圳大学第五附属医院)，广东 深圳 518100；2.深圳市宝安中医院(集团)检验科，广东 深圳 518100]

结直肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，好发于结肠和直肠部位，尤其在老年人群发病较多。近数十年，结直肠癌的发病率在全球呈上升趋势，其可能与人们生活方式的改变和饮食结构的变化有关[1]。结直肠癌早期，患者大多无明显症状，或症状略为轻微、不易发现，具有一定的隐匿性；但其中晚期容易发生全身远处转移，常见转移部位有肝脏、肺及其他器官，严重甚至危及生命[2-3]。若临床上结肠癌能做到早发现、早治疗，对提高患者的生存率和生活质量具有重要意义[4]。目前，结直肠癌的诊断主要依靠微创结直肠镜手术及病理活检[5]，同时还配合有血清癌胚抗原CEA检测；但由于结肠镜检测是侵入性检查、需繁琐的肠道准备、有穿孔的风险等，而血清CEA检测因敏感度和特异性低而存在明显的局限性，导致结直肠癌筛查难以普及[6]。有研究[2]表明，粪便DNA检测其具有无创、方便、诊断效能高等优点，检测粪便样本中SDC2甲基化水平，有助于准确预测评估结直肠癌患病情况，且标本采集方法简单，操作方便、无侵入性。本研究采用无创粪便SDC2基因甲基化联合血清CEA的检测对结直肠癌诊断分析，旨在明确其在结直肠癌诊断中的应用及评估价值。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取我院2018年1月～2020年1月收治确诊的64例结肠癌患者，58例结直肠瘤患者及60例健康对照组作为研究对象。纳入标准[3]:①均经过组织病理确诊结直肠癌，既往未接受过任何抗肿瘤治疗；②术前无远处转移病灶；③自愿参与实验，同意粪便 SDC2 基因甲基化检测及 CEA 检测。 排除标准:①肠镜检查发现其他肠道疾病；②存在全身感染性疾病、精神疾病，以及其他严重器质性病变；③近1个月有肉眼血便者。其中结直肠癌组(n=64)患者男43例，女21例；年龄35～80岁，平均(52.21±10.54)岁；结直肠瘤组(n=58)患者男38例，女20例；年龄34～78岁，平均(47.85±11.81)岁；健康对照组(n=60)男40例，女20例；年龄30～78岁，平均(48.62±9.71)岁。三组患者年龄、性别比较均差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2方法：①标本采集：抽取受试者空腹外周静脉血4 ml，以3 000 r/min 离心15 min后取血清，化学发光免疫分析法，根据试剂盒说明书，应用全自动电化学发光分析仪(CDBASE601 型)检测血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA) 含量。当血清CEA>5 μg/L，检测结果为阳性。②粪便 DNA 提取及亚硫酸盐转化：根据试剂盒说明书，利用粪便DNA 提取试剂盒从粪便样本(180～220 mg)中提取DNA。同时通过PCR 扩增验证DNA提取质量。然后采用亚硫酸氢盐转化试剂盒将对基因DNA 进行修饰，将未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。③实时荧光定量PCR测定SDC2：采用实时荧光定量PCR SDC2甲基化含量，PCR反应体系为25 μl，包括：TaKaRa EpiTaq HS(5 U/μl)0.125 μl，10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μl，25 mmol/L MgCl22.5 μl，dNTP Mixture 3 μl，正向引物 1 μl，反向引物1 μl，模板 DNA 2 μl。反应条件：95℃，5 min；95℃，30 s；54～62℃，30 s；72℃，30 s；40个循环；72℃，10 min。 EpiTect PCR 对照组DNA作为阳性对照。扩增产物在3%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，然后进行凝胶成像。

1.3观察指标：比较三组患者单独检测SDC2、CEA及联合检测的阳性率。同时通过ROC扩增曲线分析单独检测及联合检测的灵敏度和特异度。

2 结果

2.1三组患者粪便SDC2、CEA及联合检测阳性率比较:结直肠癌组、结直肠瘤组和健康对照组患者SDC2检测的阳性率分别为67.19%、55.19%和11.67%；CEA检测的阳性率为39.06%、17.24%和8.33%；联合检测的阳性率则分别是82.81%、58.62%和13.33%，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组患者粪便SDC2、CEA及联合检测阳性率比较

2.2粪便SDC2基因、血清CEA、联合检测诊断结直肠癌ROC曲线分析：ROC曲线分析发现，SDC2基因检测诊断结直肠癌AUC为0.629(95%CI：0.474～0.783)，血清CEA水平诊断结直肠癌AUC为0.512(95%CI：0.357～0.632)，联合检测诊断结直肠癌AUC 是0.782(95%CI：0.642～0.856)。联合诊断结直肠癌的AUC值最高，与单独SDC2、CEA检测比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 粪便SDC2基因、血清CEA、联合检测诊断结直肠癌ROC曲线分析

3 结论

结直肠癌是一种严重威胁人类身体健康及生命安全的恶性肿瘤，常见于中老年人，其发病率在全球男性肿瘤中居第三位，女性肿瘤中居第二位[4]。近年，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，我国直肠癌发病率和死亡率逐渐升高，并且呈年轻化趋势；每年死于结直肠癌患者人数高达数十万；而欧美发达国家结直肠癌的死亡率较我国明显降低，主要归因于大规模的结直肠癌普查，对癌前病变进行治疗干预，实现了结直肠癌的早期检测和一级预防[6]。结直肠癌的发病进展较为缓慢，早期多见结直肠黏膜病变，进而演变为腺瘤性息肉，最后发展为恶性肿瘤。若能够早发现一级预防，二级定期筛查和三级治疗，可有效促进患者预后。然而，大多数患者早期无明显症状和临床体征，同时由于缺少早期诊断，有明显症状时就诊已处于中晚期，结直肠癌患者甚至已有远处转移。因此，早诊断、早发现、早治疗提高患者的生存率，促进预后具有重要意义。

有研究发现，结直肠癌患者粪便/血液中肿瘤相关基因的改变是组织癌变的重要原因之一，其中DNA甲基化情况在结直肠癌诊断及预后具有重要指导意义[5]。学者们发现越来越多游离DNA中某些特定基因甲基化可作为结直肠癌早期诊断、预后等方面的生物标志物，如PCDH10、Septin9、RASSF2、sFPR1、SDC2等，在肿瘤的早期筛选及诊断中应用较多。结直肠癌患者术后特定基因TAC1 甲基化水平会逐渐下降，但复发时DNA 甲基化水平显著上升，可用来辅助评判结直肠癌治疗效果[6]。无创粪便SDC2基因甲基化也有报道，但联合血清CEA在结直肠癌中的诊断效能如何未见报道，本文就SDC2基因甲基化联合血清CEA检测分析评估对结直肠癌的诊断价值。本研究结果显示，结直肠癌组、结直肠瘤组及健康对照组的SDC2基因甲基化阳性检出率分别为 67.19%、55.17% 及 11.67%，说明结直肠癌组SDC2基因甲基化的阳性检出率高于结直肠瘤组和对照组，提示结直肠癌患者粪便中SDC2基因甲基化水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结直肠癌组、结直肠瘤组及健康对照组患者的SDC2与CEA联合检测的阳性率分别为82.81%、58.62%及13.33%，联合检测中结直肠癌阳性检出率显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，提示提示联合检测对结直肠癌的诊断效能优于单独检测。现阶段单一基因检测结直肠癌的灵敏度偏低，容易出现误诊或漏诊[7]。目前，已有研究证实，SDC2基因甲基化在结直肠癌诊断中具有较高的灵敏度和特异度[8-9]。本文ROC 曲线分析发现，联合诊断结直肠癌的AUC值为0.782，显著高于单独SDC2甲基化和血清CEA水平检测，因此在早期筛查中进行联合检测对提高结直肠癌诊断的灵敏度、特异性，将获益更大[10]。

综上所述，无创粪便SDC2基因甲基化联合血清CEA可有效提高结直肠癌的检出率和诊断准确性，且具有无创、方便、诊断效能高等优点，临床上值得推广。