FGFR3基因突变在膀胱癌中的诊断价值

李梦雨，富宏然，徐明鑫，于海娇，李荣辉，金 红

(牡丹江医学院1.第一临床医学院；2.附属红旗医院检验科，黑龙江 牡丹江 157011)

膀胱癌是全球发病第9位的恶性肿瘤，位居泌尿系统恶性肿瘤榜首[1-2]。膀胱癌大多数组织学类型为尿路上皮癌，可分为非肌层浸润性膀胱癌(Non-muscular invasive bladder cancer,NMIBC)或肌层浸润性膀胱癌(Muscular invasive bladder cancer,MIBC)，复发率高，生存率低[3]。FGFR3基因的突变激活会导致一些常染色体显性遗传疾病和肿瘤的发生，人们试图揭示FGFR3基因突变在膀胱癌发病机制中的作用。FGFR3基因p.R248C和p.S249C是膀胱癌中最常见的两个突变位点，本研究采用dPCR技术，对膀胱癌患者和良性膀胱疾病患者的组织进行FGFR3基因突变的研究，旨在探讨FGFR3基因两个突变位点在膀胱癌中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 纳入及排除标准 纳入标准：(1)术前经过手术或超声介导的细针穿刺病理检查诊断为膀胱癌和良性膀胱疾病，术后病理符合膀胱癌和良性膀胱疾病诊断，其中膀胱癌患者病理确诊均为移行细胞癌；(2)术前均未进行放化疗和免疫治疗；(3)石蜡切片中残留的组织DNA含量满足提取要求。排除标准：(1)由其他恶性肿瘤转移的膀胱癌患者；(2)术前进行放化疗和免疫治疗的患者。

1.1.2 一般资料 收集2019年8月至2020年12月间牡丹江医学院附属红旗医院就诊的40例膀胱癌和40例良性膀胱疾病患者的组织标本；膀胱癌组病例依据病理结果分为NMIBC组21例和MIBC组19例，男性31例，女性9例，年龄40～87岁，平均年龄(66.2±14.6)岁。根据国际抗癌协会的2017年第8版TNM分期法，Ta期15例，T1期10例，T2a期8例，T2b期3例，T3a期3例，T3b期1例。良性膀胱疾病组均为腺性膀胱炎，男性16例，女性24例，年龄43～86岁，平均年龄(65.4±15.3)岁。并且两组人群性别、年龄分布无统计学差异(P>0.05)，均为同时期和同地区收集，具有可比性。本研究严格按照赫尔辛基宣言，遵守医学伦理委员会批准协议，所有纳入研究的人员均自愿签署知情同意书。临床资料等数据资料来源于患者病例报告。

1.2 主要试剂与仪器TD-1数字PCR平台(droplet digital PCR System)和人FGFR3基因融合和突变检测试剂盒购于北京新羿生物公司，石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒(FFPE Tissue Genomic DNA Kit)购于北京全式金生物技术有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 组织标本采集与前处理 取组织标本，每标本刮取10张石蜡包埋组织切片(5 μm厚)置于1.5 mL离心管中，以二甲苯作为脱蜡剂，使用石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)提取组织DNA，储存在-80 ℃冰箱。采用定量分析法检测DNA浓度，直至提取DNA质量合格。

1.3.2 FGFR3基因突变位点的检测 使用人FGFR3基因融合和突变检测试剂盒和TD-1数字PCR平台联合检测FGFR3基因突变位点。在试剂准备区根据空白对照(DEPC水)、阳性对照及待测样本数量配制逆转录PCR扩增试剂预混液，组成30 μL反应体系：9 μL预混液A(DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、UTP、氯化镁和缓冲液)，3 μL预混液B(逆转录酶、RNA酶抑制剂)，3 μL检测液(引物、探针)，3 μL阳性对照(FGFR3基因融合和突变阳性质粒DNA、阴性细胞系总RNA)和20 ng肿瘤DNA。参照北京新羿生物公司提供的说明书生成液滴，在4 ℃环境下1 h内进行一步法逆转录扩增反应：55 ℃逆转录15 min，95 ℃热启动10 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸1 min，40个循环后，12 ℃仪器冷却5 min。在生物芯片分析仪上检测液滴，结束后进行数据分析。

1.4 统计学方法将本研究收集的样本资料使用Spss 23.0软件处理与分析数据。计量资料以“均数±标准差”表示。计数资料以相对数表示，组间差异采用卡方检验或Fisher确切概率法。绘制ROC曲线判断FGFR3基因突变的诊断价值，AUC组间差异的比较使用z检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组和良性膀胱疾病组中FGFR3基因突变比较FGFR3基因在膀胱癌组中，FGFR3位点p.S249C的突变率为50.00%(20/40)，位点p.R248C的突变率为27.50%(11/40)；在良性膀胱疾病组中，FGFR3位点p.S249C的突变率为10.00%(4/40)，位点p.R248C的突变率为0.00%(0/40)。FGFR3基因在膀胱癌中有很高突变率，膀胱癌组与良性膀胱疾病组相比较FGFR3基因突变率明显升高，具有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 膀胱癌和良性膀胱疾病中FGFR3基因突变比较

2.2 膀胱癌组织FGFR3两个突变位点的关联性在40例膀胱癌组织标本中，总突变率为57.50%(23/40)，20例p.S249C位点突变样本中有8例同时发生了p.R248C位点突变，即患者存在两点突变，二者一致性为40.00%(8/20)；20例p.S249C突变阴性中，3例p.R248C突变，P>0.05；FGFR3两个位点突变无关联,见图1、表2。

图1 突变位点韦恩图

表2 膀胱癌组织FGFR3两个突变位点的关联性

2.3 FGFR3基因突变与膀胱癌各临床参数的关系FGFR3基因突变在不同年龄组中比较，差异有统计学意义，但单个点突变与年龄无关；在肿瘤大小方面比较，差异具有统计学意义；在肿瘤是否复发中比较，差异也有统计学意义，但p.S249C突变与复发无关；与MIBC相比，FGFR3突变在NMIBC中有很高检出率，在不同的病理分级比较中有明显统计学差异，FGFR3总突变的χ2=6.320，P=0.012,见表3。

表3 FGFR3基因突变与膀胱癌各临床参数的关系

2.4 绘制FGFR3两个突变位点诊断膀胱癌的ROC曲线通过绘制ROC曲线，计算出敏感性、特异性和曲线下面积AUC,见表4、图2。

表4 两个突变位点的敏感性和特异性(%)及AUC

图2 FGFR3两个突变位点的ROC曲线

3 讨论

FGFR3基因在膀胱癌组中，FGFR3位点p.S249C的突变率为50.00%(20/40)，位点p.R248C的突变率为27.50%(11/40)；在良性膀胱疾病组中，FGFR3位点p.S249C的突变率为10.00%(4/40)，位点p.R248C的突变率为0.00%(0/40)。FGFR3基因在膀胱癌中有很高突变率，膀胱癌组与良性膀胱疾病组相比较FGFR3基因突变率明显升高，具有统计学意义(P<0.01)FGFR3又称成纤维细胞生长因子受体3，是四个高度保守却结构相关的酪氨酸激酶受体家族中的一员。它位于4p16.3号染色体上，由19个外显子和18个内含子组成，以往在遗传性侏儒症中对FGFR3的研究证实不同的疾病表型在FGFR3上有其不同的基因突变位点，这些突变有规律性和好发性[4]。FGFR3基因突变、易位和重组、过表达都易导致FGFR3基因过度活跃，可导致多发性骨髓瘤、黑色素瘤和宫颈癌等恶性肿瘤发生[5-6]。目前，FGFR3在膀胱癌中的突变类型仅发现有点突变一种形式，即FGFR3基因序列中发生碱基替换，导致其翻译表达的蛋白质分子中一种氨基酸被另一种氨基酸所替代，发生错义突变。

在本研究中，FGFR3突变在不同年龄组中比较，差异有统计学意义；在肿瘤大小方面比较，差异具有统计学意义；在肿瘤是否复发中比较，差异也有统计学意义，P值均小于0.05。以上结果说明FGFR3突变与膀胱癌患者的年龄有关，肿瘤≥3D/cm的膀胱癌患者更易检测出FGFR3突变，而与肿瘤分期无关，这与报道有差异[7]。与肌层浸润性膀胱癌相比，FGFR3突变在非肌层浸润性膀胱癌中有很高检出率，FGFR3总突变的P值为0.012，与文献报道相符[8-9]。不仅如此，FGFR3突变对肿瘤复发也有一定的影响，与膀胱癌的预后密切相关，因本研究时限较短，未对其做预后分析，但相关文献报道称含有FGFR3突变的低肿瘤异质性患者总生存期比所有患者的总生存期长(P=0.044)[10]，利用FGFR3基因监测膀胱肿瘤复发的敏感性和特异性高达70%和87%[11]。在检测FGFR3突变时，本研究采用了dPCR技术，与传统定量PCR(qPCR)技术相比具有更加出色的灵敏度、特异性和精确性。膀胱癌组FGFR3位点p.S249C的突变率为50.00%(20/40)，位点p.R248C的突变率为27.50%(11/40)，总突变率为57.50%(23/40)。一项研究表明，膀胱癌中最常见的突变部位是S249C，约占突变总数的61%[12]，突变率与本研究的结果存在差异，分析原因为本研究样本量较少，可以通过提高样本量再做统计分析。本研究以膀胱癌组和良性膀胱疾病组为研究对象绘制FGFR3两个位点突变的ROC曲线，得到两者诊断膀胱癌的敏感性、特异性和AUC，结果显示，p.S249C位点突变敏感性较高，为50.0%，AUC为0.700；p.R248C位点突变敏感性略低，但诊断特异性高达100.0%，AUC为0.638，同时检测FGFR3两个位点突变可提高诊断效能。

在精准医疗快速发展的今天，组织活检临床应用有限，需要更多研究定义肿瘤标志物[13]。国外利用液体活检对癌症进行基因突变的检测，取得了一定的成果[14-15]。本研究为后续在液体活检中检测FGFR3基因突变打下一定的基础。

综上所述，FGFR3基因突变与膀胱癌的发生发展密切相关，在非肌层浸润性膀胱癌中易突变，其中p.S249C位点突变较高，未来有望应用于临床中实现对膀胱癌的早期筛查。