姜黄素对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响及机制

陈林津，李 岩，肖韩艳

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的最常见病因，是临床研究重点。AS是一个复杂的过程，涉及多种细胞和分子。巨噬细胞极化是动脉粥样硬化的重要病理生理环节。巨噬细胞极化是近年来动脉粥样硬化治疗研究的热点，巨噬细胞通过细胞内外受体感受微环境中不同的极化信号，通过不同的信号转导途径调控基因表达，成为具有不同表型和功能的M1型和M2型巨噬细胞[1]。本研究从调节巨噬细胞极化方面探讨姜黄素对AS的调控作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组4周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠12只(购于维通利华公司)。随机分3组，每组4只。空白组：给予高脂饮食+等量1 %羧甲基纤维素钠灌胃；高浓度姜黄素组：给予高脂饮食+姜黄素200 mg/(kg·d)灌胃；低浓度姜黄素组：给予高脂饮食+姜黄素30 mg/(kg·d)灌胃，1次/d，连续8周。

1.2 实验材料和器材姜黄素(美国Sigama公司)；羧甲基纤维素钠(湖南汇虹试剂有限公司)；高脂饲料(派克生物公司，由Reasearch Diet生产)；iNOS、Arg-1、NF-κB、IL-10、β-actin抗体(Sangon公司)；低温离心机(Eppendorf公司5804R)；-80 ℃冰箱(Thermal公司)；PCR自动系列化分析仪(Bio-rad公司Thermal Cycler S1000)；Ttotal RNA Kit(Omega公司R6834-02)；Transcriotor first strand cDNA synthesis Kit(Roche公司04897030001)；实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)；FastStart universal SYBR Green Master(Roche公司RC-4913914001)。

1.3 血脂检测ApoE-/-小鼠灌胃8周，禁止饮食不禁水12 h后，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，剪去腹部毛发，开腹从腹主动脉中取血，样本室温静置1.5 h，4 ℃、4000 rpm/min离心10 min，吸取上层血清进行血脂检测。

1.4 HE染色取小鼠主动脉，生理盐水冲洗三遍，10 %甲醛溶液固定12 h，石蜡包埋，切片为5 μm厚度，进行HE染色，利用光学显微镜进行观察并拍照记录，进行图片数据分析，计算校正斑块面积(斑块面积/血管横截面积)%。

1.5 免疫荧光定量PCR(Rt-qpcr)利用Omega RNA提取试剂盒处理小鼠主动脉组织，根据RNA提取试剂盒里提供的说明书按要求步骤提取总RNA。以β-actin为内参基因，利用SYBR Green Master(Roche)进行检测iNOS、Arg-1、IL-10、NF-κB的mRNA水平，所有数据均重复测三次，计算iNOS/Arg-1。基因引物序列如表1所示。

表1 各引物序列

目的基因使用相对定量法用2-△△Ct计算mRNA表达量。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以“均数±标准差”表示。各组间比较采用单因素方差分析及t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对ApoE-/-小鼠血脂的影响与空白组相比，高浓度姜黄素组小鼠血清中TC、LDL-C的含量均降低(P<0.05)，而低浓度姜黄素组差异无统计学意义；高浓度姜黄素组与低浓度姜黄素组各指标水平均有差异，表明姜黄素对于血脂调控的作用在于降低了小鼠血清中TC与LDL-C的含量(P<0.05)，且有浓度依赖性，见表2。

表2 各组ApoE-/-小鼠血脂检测结果

2.2 姜黄素对动脉粥样硬化斑块的影响40倍镜下发现各组均有动脉粥样硬化斑块的出现(见图1)；利用计算机软件校正斑块面积，结果显示高浓度姜黄素组校正斑块面积低于空白组，二者差异有统计学意义(P<0.05)，低浓度姜黄素组校正斑块面积差异无统计学意义(见表3)。表明姜黄素浓度依赖的影响动脉粥样硬化斑块，减轻ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变。

图1 各组ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块HE染色的结果(×40)

表3 各组主动脉弓校正斑块面积百分比

2.3 姜黄素对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞及炎症因子的调控作用相比空白组，高浓度姜黄素下调NF-κB、iNOS基因表达(P<0.05)，上调Arg-1、IL-10基因表达(P<0.05)，低浓度姜黄素组以上因子差异无统计学意义。这表明，姜黄素可以减轻动脉粥样硬化斑块的炎症反应，升高抑炎因子IL-10，使巨噬细胞向M2方向极化，减小M1/M2巨噬细胞比值，由此达到对动脉粥样硬化的调控作用，且姜黄素对炎症的抑制和对巨噬细胞的调控具有浓度依赖性，见表4。

表4 各组ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中iNOS、Arg-1、IL-10、NF-κB相对基因表达量

3 讨论

动脉粥样硬化的发生，发展是复杂的过程。动脉粥样硬化的发病机理尚不完全清楚[2]，炎症反应和脂质沉积在动脉壁是目前较公认的动脉粥样硬化的主要因素，并且动脉粥样硬化疾病预后的关键是动脉粥样硬化斑块的稳定性[3]，炎症反应中人体的各种免疫系统被激活，表达各种炎症因子，造成血管内皮功能的损害以及影响平滑肌细胞的增值与迁移从而下降了动脉粥样硬化斑块的稳定性。并且黄跃平等作者研究发现[4]，ApoE-/-小鼠血管内存在的炎症反应，可以使动脉粥样硬化斑块的不稳定性增加。进一步提示了炎症对动脉粥样硬化斑块具有影响。特别是在冠状动脉和颈动脉，狭窄的血管管腔里的动脉粥样硬化斑块的不稳定及破裂[5]导致冠状动脉粥样硬化型心脏病的临床症状，严重可危及生命。

目前如何控制动脉粥样硬化的发生及发展已经成为临床研究的重点。中药以其独特的多位点多方面的作用引起国内外研究者的关注，其中多个临床Ⅰ期试验已证实，姜黄素安全并且耐受性好，有研究提示[6]姜黄素可以通过改善糖代谢，脂肪代谢，抑制炎症反应，刺激抗氧化酶，清除氧自由基、抗细胞增殖、促进细胞凋亡和保护内皮细胞等途径起到对动脉粥样硬化的调控作用。在本实验中，通过建立ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，并通过HE染色切片观察动脉粥样硬化斑块计算校正面积，进一步证实了姜黄素具有抗动脉粥样硬化病变的作用。

已有研究表明[7]炎症物质可以通过MAPK/NF-κB通路诱导炎症反应参与AS病变全过程。本研究发现姜黄素可以使动脉粥样硬化组织中NF-κB表达下降，提示姜黄素可能是通过MAPK/NF-κB通路对动脉粥样硬化进程中炎症反应进行调控，进而调控动脉粥样硬化进展。

目前研究表明巨噬细胞的极化对动脉粥样硬化形成、发展、消退具有影响[8]，动脉粥样硬化病变部位炎症环境诱导外周的单核细胞向斑块内迁移，并由于微环境条件的不同，可以诱导巨噬细胞向M1/M2方向极化，从而导致M1/M2的比值也在变化[9]。Gjurich,BN等作者的一项实验表明[10]，在ApoE-/-小鼠的主动脉中，伴随着IL-10的降低动脉粥样硬化程度也升高。另外白瑞娜等作者表明[11]，M2巨噬细胞可以分泌IL-10抗动脉粥样硬化，并且IL-10也具有使M1巨噬细胞向M2方向的双重作用。本实验发现高浓度姜黄素能够增加AS模型小鼠动脉粥样硬化斑块组织中IL-10的表达，并与M2巨噬细胞标志物Arg-1表达上调趋势一致。提示姜黄素可以上调IL-10的表达使巨噬细胞向M2方向极化，且具有浓度依赖性。TLR4-MAPL/NF-κB通路参与巨噬细胞极化。已有研究发现[12]激活PI3K/Akt信号通路中的关键信号因子NF-κB，可导致巨噬细胞向M1极化、迁移，促进炎性细胞因子分泌。本实验发现姜黄素下调转录因子NF-κB的表达，与M1巨噬细胞标志物iNOS表达下调趋势一致，提示姜黄素通过下调PI3K/Akt/NF-κB信号通路减少巨噬细胞向M1型极化。故姜黄素能够调控巨噬细胞极化，改变M1/M2的比值。其中M1型巨噬细胞能够分泌iNOS加重动脉粥样硬化组织的炎症反应，导致动脉粥样硬化斑块进展，加重动脉粥样硬化病变[13]。M2型巨噬细胞释放TGF-β促进斑块纤维组织形成，从而增强动脉粥样硬化斑块的稳定性，激活PPARγ信号通路来发挥更强的吞噬作用，并抑制炎症反应[11，14]。本实验发现姜黄素减少巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，增加向M2巨噬细胞极化，下调M1/M2的比值，使动脉粥硬化斑块稳定性增加。

综上所述，本实验通过建立ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型应用姜黄素干预，发现姜黄素降低了AS模型小鼠血脂水平，减少了主动脉粥样硬化斑块面积，可能机制是通过MAPK/NF-κB通路抑制动脉粥样硬化斑块组织炎症反应，上调IL-10的表达使巨噬细胞向M2方向极化，下调PI3K/Akt/NF-κB信号通路减少巨噬细胞向M1型极化，减小了M1/M2巨噬细胞比值，增加动脉粥样硬化斑块稳定性。