乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌的益生作用

丁 婷，李 勇

益生菌是一类定植于人体肠道、生殖系统内，能改善人体微生态平衡，发挥有益作用的活性微生物[1]。它不仅是一种食品补充剂，而且具有多种生理功能，如控制体内毒素，提高免疫力，预防病菌感染，降血压，调节胆固醇，抑肿瘤，减少食物过敏反应，缓解乳糖不耐受症状，预防心血管疾病以及延缓衰老等。尤其在调节肠道菌群组成，改善胃肠道功能，维持肠道生态平衡和健康等方面具有特殊的功效[2-6]。当人体某些生理条件改变时，如病原菌感染、抗生素类药物的使用等会引起肠道菌群紊乱，肠道微生态环境发生变化，导致一系列症状的发生，如腹泻、便秘、肠胃炎等，影响人体健康，此时需要补充益生菌。然而，益生菌产品在加工、运输、贮藏、销售以及食用过程中活菌数下降很快，温度、基质及氧气等外界因素均会影响菌株的活力，某些益生菌对营养条件要求很高，对氧气极为敏感，对低pH 环境抵抗力差，活性保持较困难[7-8]。此外，益生菌在食用后需通过胃环境，然而，因胃酸的杀菌作用，致活性益生菌大量死亡。这也使很多市售益生菌产品的活菌数降低，达不到对人体的益生效果。添加益生菌促生长因子（益生元）是提高益生菌存活率的有效途径。现被广泛应用的益生元有菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、葡聚糖等，然而，这些快速发酵性寡糖能引起人体腹泻和胀气等弊端[9]。探索对益生菌有益生效应的物质及方法，提高其对高温、氧气、胃酸及胆汁等不良环境因子的抵抗能力，增强对人体生理健康的维护作用具有重要意义。

嗜酸乳杆菌是益生菌家族中的一种，其营养保健及治疗作用受到越来越多的关注。嗜酸乳杆菌具有抑制肠道不良微生物的增殖，增强机体免疫力，提高乳糖消化性等多种益生功能，在食品工业中有着广泛的应用[10-11]。乳清蛋白水解物（Whey Protein Hydrolysate，WPH）是通过将新鲜的甜味乳清经特殊工艺处理后，再经酶解得到的肽和游离氨基酸的混合物，具有提高产品营养和功能的作用，常用作营养补充剂或应用于运动营养等领域。本研究以嗜酸乳杆菌为研究对象，探究乳清蛋白水解物对细菌的益生效应及机制，为提高益生菌的存活率和市售产品的稳定性、营养性提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）JC1 由本实验室保藏。菌株使用前按照1%的比例接种于灭菌的MRS 肉汤培养基中摇床培养24 h （37 ℃，160 r/min），经3 次传代，使菌种恢复活力。MRS 液体培养基购自北京奥博星生物技术有限公司。乳清蛋白水解物 （8350 Whey Protein Hydrolysate，Hilmar 公司提供）为淡黄色粉末，主要成分为蛋白质、肽和氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量较多。

1.2 WPH 浓度对嗜酸乳杆菌生长的影响

将MRS 液体培养基用移液管分装到20 mL厌氧管中，置于121 ℃灭菌锅中灭菌15 min。以MRS 培养基为空白对照，分别加入0.2%，0.4%，0.8%，1.6%的WPH，以1.6%菊粉作为对照，接种活化3 代的1%嗜酸乳杆菌，37 ℃培养24 h，每隔4 h 取1 次样，用MRS 固体培养基（MRS 固体培养基为液体MRS 培养基添加1.5%琼脂） 采用二倍稀释法进行样品稀释，取3 个合适的稀释度，每个稀释度3 个重复，37 ℃恒温培养48 h 后对嗜酸乳杆菌进行活菌计数，绘制生长曲线。

1.3 嗜酸乳杆菌生长变化规律研究

微生物生长动力学模型可以计算微生物的延滞期和最大比生长速率等数值。常用的微生物生长动力学模型有：Gompertz 模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic 模型、Monod 模型、Baranyi and Robertz 模型、Richards 模型、Stannard 模型和Schnute 模型等[12]。分别用修正的Gompetz 模型、修正的Logistic 模型非线性拟合不同培养基中的嗜酸乳杆菌随时间的变化情况并描述微生物的变化规律。

（1）修正的Gompertz 模型 修正的Gompertz模型表达式为：

式中：t——时间，h；Nt——时间t 时的菌数，CFU/mL；Nmax——最大菌数，CFU/g；N0——初始菌数，CFU/g；μmax——最大生长速率，h-1；λ——生长延滞时间，h。

（2）修正的Logistic 模型 修正的Logistic 模型的公式为：

式中：Nt——t 时的菌落数的对数值，CFU/mL；N0——初始菌落数CFU/mL；A——拟合参数；μmax——最大比生长速率，h-1；λ——生长延滞时间，h。

1.4 嗜酸乳杆菌对WPH 的利用情况

称取8.6 mg 异硫氰酸荧光素溶于0.2 mL 0.1 mol/L 的氢氧化钾溶液中振荡均匀，加入1.6 mL 0.1 mol/L pH 值为8.3 的碳酸盐缓冲液（Na2CO3/NaHCO3），滴入1 mL 含有0.4%乳清蛋白水解物的溶液，避光反应4 h 后进行异硫氰酸荧光素标记。将标记好的溶液加入MRS 培养基中，随之接种1%嗜酸乳杆菌，于37 ℃培养24 h 后，吸取2.5 μL 菌液于洁净载玻片，用激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）（TCSSP8，Leica company，德国）进行观察。最大发射波长：520～530 nm，最大吸收波长：490～495 nm。

1.5 WPH 对嗜酸乳杆菌生物被膜产生的影响

1.5.1 生物被膜定量测定 嗜酸乳杆菌菌株按照1%比例接种于MRS 肉汤培养基中摇床培养24 h（37 ℃，160 r/min）。按1∶100 比例稀释后取100 μL 菌液加入96 孔板中，分别加入0.2%，0.4%，0.8%，1.6%的WPH，以1.6%的菊粉作为对照，MRS 肉汤做为空白对照。将96 孔板放置于37 ℃培养箱中静置48 h。培养后，用无菌PBS 缓冲液冲洗3 遍以除去未黏附的细菌。XTT 用PBS 配置为0.5 mg/mL 储备液，并用0.22 μm 滤膜过滤，-70 ℃贮藏。维生素K3 用丙酮溶解（10 mmol/L）。将维生素K3 加入XTT 中达到1 μmol/L 浓度。将200 μL 的XTT-维生素K3 溶液加入96 孔板中，置于37 ℃培养箱中避光放置2 h 后，在490 nm 下用酶标仪进行测试。每个样品重复4 次取平均值。

1.5.2 生物被膜显微镜观察 嗜酸乳杆菌菌株按照1%的比例接种于MRS 肉汤培养基中摇床培养24 h （37 ℃，160 r/min）。按1∶100 比例稀释后取200 μL 菌液加入无菌平板中，分别加入1.6%的WPH、MRS 肉汤（对照）。向平板底部放入无菌盖玻片后于37 ℃静置培养48 h，用超纯水润洗盖玻片3 次，0.4%结晶紫染色20 min，在油镜下观察细菌生物被膜情况。

1.6 WPH 对嗜酸乳杆菌EPS 的影响

嗜酸乳杆菌菌株按照1%的比例接种于MRS肉汤培养基中摇床培养24 h（37 ℃，160 r/min）。按1∶100 比例稀释后取200 μL 菌液加入无菌培养皿中，分别加入1.6%的乳清蛋白水解物、MRS 肉汤（对照）。每个平板底部放有1 片打磨过的锌片（0.5 mm×0.5 mm×0.3 mm），其作用是使生物被膜黏附于锌片上。将平板放置于37 ℃培养箱中静置培养48 h。培养后，将锌片取出，用无菌水缓缓冲洗3 遍以除去未黏附的细菌。干燥30 min 后用拉曼光谱仪（LabRAM HR Evolution Raman spec trometer，HORIBA Scientific company，法国）对EPS的化学成分进行测试。激光光源波长：532 nm；激光光源功率：25 mW；50 倍物镜；5 次曝光次数；检测光谱范围：100～3 500 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 WPH 对嗜酸乳杆菌生长的影响

通过测定嗜酸乳杆菌的生长曲线来考察WPH 对其生长的影响。图1为添加WPH 的嗜酸乳杆菌数量随时间的变化情况。从图中可以看出，嗜酸乳杆菌在MRS 培养基中增殖迅速，细菌快速进入对数生长期，迟滞期较短，菌体大量生长繁殖；而后细菌生长曲线趋于平稳，细菌的生长进入稳定期；后期由于乳酸等代谢产物不断累积，降低了发酵液的pH 值，细菌生长环境逐渐恶劣，菌体代谢逐渐缓慢，活菌数开始下降，菌体逐渐衰老死亡，进入衰亡期。添加菊粉后细菌增加较空白组显著，但到后期细菌生长逐渐缓慢。而添加WPH 的培养基增菌效果较菊粉更好，试验组活菌数都比空白组有明显提高，且浓度增大增菌效果更加明显。不仅将细菌生长的对数期提前，稳定期也延长，稳定期期间添加0.2%，0.4%，0.8%，1.6%的培养基中活菌数分别达到了1.07×109，2.40×109，1.02×1010，1.48×1010CFU/mL。由此表明乳清蛋白水解物可以增强细菌的代谢速率，促进有益菌的增殖。用微生物生长动力学模型探究嗜酸乳杆菌生长的变化规律，将细菌的生长曲线分别用修正的Gompertz 方程以及修正的Logistic 方程进行非线性拟合发现，修正的Gompertz 方程和修正的Logistic 方程可以很好地拟合嗜酸乳杆菌的生长曲线，大部分数据点都在拟合曲线上或离拟合曲线较近，这两个方程能较好地反映嗜酸乳杆菌随时间的变化情况及生长动态。不同微生物生长动力学方程拟合效果也可由决定系数（R2）来判定。R2值越大，说明微生物生长曲线与微生物生长动力学方程拟合程度越好。从表1中可以看出，用不同微生物生长动力学方程拟合不同培养基中嗜酸乳杆菌的生长数据后得到的决定系数值各不相同。其中，用修正的Gompertz 方程可以得出微生物生长曲线的最大比生长速率和延滞期。拟合后发现所有的R2>0.98988，用修正的Logistic 方程拟合后所有的R2>0.98924，也表明两个方程能很好地描述微生物的生长动态。生长速率是研究对数生长情况下微生物群体生长规律的重要参数，不仅可以估算某一时刻的菌体浓度，还可以作为判断微生物生长情况和环境关系的一个指标。微生物生长动力学方程非线性拟合相关参数如表1所示。从表中可以看出，乳清蛋白水解物和菊粉的添加对细菌的最大比生长速率和延滞期影响显著。添加乳清蛋白水解物和菊粉后，细菌的最大比生长速率（μmax）比空白组增加；延滞期（λ）缩短。WPH对μmax和λ 的作用比菊粉更明显。以上结果可以得出，乳清蛋白水解物能促进细菌增殖，使其提前进入对数生长期，乳清蛋白水解物可以作为益生菌的促生长因子使用，且是一种具有巨大应用价值的益生元。

图1 嗜酸乳杆菌的生长曲线用微生物生长动力学方程拟合结果Fig.1 Growth curve of L.acidophilus JC1 fitted with microbial growth kinetic equation

表1 嗜酸乳杆菌不同微生物生长动力学方程非线性拟合相关参数Table 1 Nonlinear fitting parameters of different microbial growth kinetics equations of L.acidophilus JC1

2.2 嗜酸乳杆菌对WPH 的利用情况

向嗜酸乳杆菌的液体培养基中加入经异硫氰酸荧光素染色的乳清蛋白水解物，异硫氰酸荧光素中的异硫氰酸基团可以与WPH 中的氨基酸发生共价结合，从而能够在激光共聚焦显微镜下观察到嗜酸乳杆菌对乳清蛋白水解物的利用情况。CLSM 发现绝大部分细菌内都发现有荧光标记的乳清蛋白水解物。嗜酸乳杆菌可以很好地利用WPH，荧光标记的WPH 大都分布在细菌的细胞质中，表明乳清蛋白水解物中的大部分物质可以自由透过细菌的细胞膜进入细菌中供细菌进行各项代谢活动并提供所需能量。

2.3 WPH 对嗜酸乳杆菌生物被膜的影响

从图3乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌生物被膜的定量测定可以看出，菊粉和乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌生物被膜的产生均具有促进作用，但是乳清蛋白水解物的促进作用更加明显，且浓度越高，促进作用越显著。当乳清蛋白水解物质量分数分别为0.2%，0.4%，0.8%，1.6%时，细菌生物被膜含量较空白组分别增加了22.15%，53.68%，69.79%和96.64%（P<0.01）。定量试验结果表明乳清蛋白水解物显著促进了嗜酸乳杆菌生物被膜的产生。

图2 激光共聚焦显微镜观察嗜酸乳杆菌对乳清蛋白水解物的利用情况Fig.2 Utilization of WPH to L.acidophilus JC1 by CLSM

图3 定量测定乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌生物被膜的影响Fig.3 The effect of WPH on the biofilm of L.acidophilus JC1 by quantitative determination

从图4可以看出，光学显微镜下嗜酸乳杆菌的生物被膜经结晶紫染色后，对照组的细菌分布较为分散，生物被膜含量较少，而添加乳清蛋白水解物后，细胞聚集成团，形成大片的、致密的生物被膜，细菌包裹于生物被膜中，形成复杂的三维结构，表明乳清蛋白水解物显著刺激了嗜酸乳杆菌生物被膜的产生。这一结论与生物被膜定量试验相吻合。

图4 显微镜观测乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌生物被膜的影响Fig.4 The effect of WPH on the biofilm of L.acidophilus JC1 by optical microscope

2.4 乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌胞外聚合物的影响

通过拉曼光谱测试可以检测乳清蛋白水解物的添加对嗜酸乳杆菌EPS 化学成分的影响。由图5可以看出，添加乳清蛋白水解物后，细菌所产生的EPS 拉曼光谱峰峰强度增加。

通过比对拉曼光谱特征峰[13]对应物质可以看出（图5a），嗜酸乳杆菌所产胞外聚合物的主要成分为蛋白质、碳水化合物和脂质等物质。未添加乳清蛋白水解物时，其EPS 拉曼光谱图显示，在600 cm-1附近的拉曼条带中对应的物质主要是变形芳环拉伸环孢菌素、苯丙氨酸结构，这种物质在EPS中含量较高。在1 030～1 130 cm-1是碳水化合物，其变形振动主要由-C-C-、C-O 以及C-O-H 引起。在1 200～1 290 cm-1主要是Amide III；在1 343 cm-1左右的拉曼光谱条带对应的物质主要是蛋白质（amide III）；在1 855～2 920 cm-1表明，嗜酸乳杆菌产生的EPS 中含有CH2基团、CH3基团以及孢粉素和脂质。添加乳清蛋白水解物后，拉曼光谱（图5b）显示，600 cm-1处对应的碳水化合物明显增加；1 343 cm-1处对应的蛋白质含量也显著增加；2 920～1 855 cm-1的拉曼光谱所对应的Amide I、不饱和脂质、孢粉素，脂质等物质也显著增加。以上结果表明乳清蛋白水解物的添加显著刺激了嗜酸乳杆菌产生EPS 的能力。

图5 拉曼光谱检测乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌EPS 的影响Fig.5 Effect of WPH on EPS of L.acidophilus JC1 by Raman spectroscopy

3 讨论

嗜酸乳杆菌是一种重要的益生菌，在发酵过程中，它能产生大量的乳酸、醋酸及胞外多糖等物质，这些物质对调整肠道菌群平衡、促进肠道消化、平衡身体内的酸碱度以及控制体内毒素等至关重要。但是益生菌在加工、销售过程中往往会受到来自外界不利条件的影响，且以口服形式进入人体肠道内的益生菌必须通过胃环境，致使其活性和存活率大幅度下降[14-16]。因此益生菌的增殖培养变得越来越重要。据研究报道，添加外源有益菌增菌的物质，可以刺激益生菌生长与活性。Dave等[17]研究发现蛋白水解物能够加速发酵过程中益生菌的生长繁殖。Martone[18]从鳕鱼鱼片废料中得到一种高溶性的鱼蛋白水解物。他们发现水解蛋白能促进盐生细菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的生长，可作为微生物培养的替代底物。Mccomas 等[19]也发现，乳清蛋白水解物可以促进益生菌（长双歧杆菌S9、嗜酸乳杆菌O16 和嗜酸乳杆菌L-1） 在不同的酸奶培养物组合中的生长。乳清蛋白水解物可作为促进益生菌生长的益生元。Castro 等[20]报道了大豆分离蛋白、牛乳清蛋白和蛋清蛋白水解液对嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳杆菌 （Lactobacillus delbrueckii）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和乳酸双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）的生长有积极的促进作用。因此探究乳清蛋白水解物对益生菌的生长刺激作用，探究其作为新型益生元使益生菌发挥长效作用切实可行，且将会有巨大的应用潜力。

在嗜酸乳杆菌的培养基中添加乳清蛋白水解物后，细菌的增殖速度加快，对数期提前，稳定期延长，表明乳清蛋白水解物增强了细菌的代谢速率，这可能是由于乳清蛋白水解物增加了细菌对逆环境的耐受性的缘故。胞外聚合物是细菌在一定环境下分泌的一些高分子聚合物。细菌包裹于这些聚合物中形成复杂的生物被膜结构，通过这些结构可以使细菌抵御杀菌剂和其它有毒物质的侵害[21-22]。而生物被膜和EPS 的产生均受到细菌群体感应（Quorum Sensing,QS）系统的调控[23-25]。QS 是一种细菌之间进行通讯与交流的机制，也是细菌根据自身群体密度来调整其生理和生化特性的过程。细菌能够产生、释放和识别被称为自诱导物（Autoinducers,AIs）的胞外信号分子，AIs 会随着细菌密度的增加而累积，一旦达到种群密度的阈值浓度，信号分子就会被多种受体感应，进而激活或抑制特定靶基因的表达，导致细菌的多种群体性行为的产生，如生物被膜的产生、细菌胞外酶的分泌、质粒转移，抗生素合成等[26-28]。已有研究证明，生物被膜状态下的益生菌比浮游状态下的益生菌具有更显著的免疫调节作用[29]。Cheow 等[30]发现，与常规益生菌微制剂相比，高密度生物被膜状态下益生菌制备的微制剂具有更好的抗冷冻干燥能力、耐热性和耐酸性。Chew 等[31]发现益生菌鼠李糖乳杆菌GR-1 和罗伊氏乳杆菌RC-14 可以抑制或干扰致病菌光滑念珠菌生物被膜的形成。Vuotto 等[32]研究发现，益生菌可以用来对抗生物被膜相关的感染性疾病。因此，添加乳清蛋白水解物后，嗜酸乳杆菌的生物被膜加厚，EPS 分泌增加，乳清蛋白水解物对益生菌的益生效应很可能是因为其促进了由QS 系统调控的生物被膜和EPS 的产生，从而增加了细菌对不良环境的抵抗性所导致。益生菌生物被膜的形成受到多种因素的影响。据报道，培养基中营养物质的缺乏及限制碳源营养物质供给会促进鼠李糖乳杆菌GG 生物被膜的形成[33]。Slizova 等[34]发现培养基中吐温-80 及糖的含量和种类在罗伊氏乳杆菌生物被膜的形成过程中发挥了重要作用。因此，有目的的控制乳清蛋白水解物的添加量，可以靶向提高嗜酸乳杆菌生物被膜的形成，对提高益生菌的活性具有指导意义。

4 结论

本研究考察了乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌的生长曲线、生物被膜产生以及EPS 的影响，发现乳清蛋白水解物不仅促进了嗜酸乳杆菌的生长繁殖，且增加了细菌生物被膜和EPS 的分泌量。乳清蛋白水解物对嗜酸乳杆菌的生长的促进作用很可能跟细菌的群体感应效应有关。乳清蛋白水解物具有作为益生元的潜力，可作为促进益生菌生长的新型增殖因子，为改善相关产品的质量，提高产品的营养价值提供参考。