pH值对纯化猪肉肌球蛋白热聚集体的影响

娄爱华，潘 腾，陈 星，沈清武，张 炎，罗 洁，*

肌球蛋白是肌肉中含量最高的蛋白质，也是肌肉中最重要的蛋白质，约占总蛋白含量的三分之一，是纤维状蛋白质的一种[1]。肌球蛋白整体形状如豆芽状，约160 nm 长，分子质量约480 ku[2]，由两条肌球蛋白重链（MHC，分子质量220 ku）与4 条肌球蛋白轻链（LC，分子质量17～22 ku）组成[3]。肌球蛋白是盐溶性蛋白，其热诱导凝胶特性影响肉制品的感官特性和质构特性等[4]。

肌球蛋白热诱导凝胶的形成包括两个阶段，首先是肌球蛋白受热变性，蛋白结构打开，之后是肌球蛋白聚集进而形成大的凝胶体，形成凝胶[5-6]。热处理过程中，肌球蛋白聚集体的形成状态影响最终蛋白凝胶体的结构与功能特性。不同离子种类及pH 值条件下，肌球蛋白变性聚集速率不同，形成不同大小的聚集体。研究发现[7-8]，不同大小肌球蛋白聚集体在加热过程中均可形成凝胶，然而，

小的蛋白聚集体形成粗糙的网络结构，大的蛋白聚集体形成链状网络结构，二者凝胶特性不同。溶液pH 值的改变会改变蛋白质氨基酸侧链的电荷分布，同时引起蛋白质二级结构发生改变，二级结构构象的改变决定蛋白质内部活性基团的暴露程度，影响分子间的相互作用，最终影响蛋白质聚集体的形成[9-10]。目前研究多集中于兔肉、鸡肉以及鱼肉中提取的肌球蛋白，针对pH 值对猪肉肌球蛋白的影响仍多为对蛋白凝胶形成特性的影响[11～13]。明确pH 值对猪肉肌球蛋白热聚集过程中聚集体结构改变的影响机制，有利于实现对猪肉肌球蛋白热聚集行为的调控，从而达到良好的蛋白凝胶状态。

本文通过制备猪肉肌球蛋白，利用浊度值与粒径分布，研究在不同pH 值条件下肌球蛋白热聚集体大小。同时通过肌球蛋白热变性动力学描述，评估肌球蛋白热稳定性的差异，并对蛋白质结构稳定性、肌球蛋白变性温度、热聚集体形态观察进行热聚集体形态结构分析，旨在阐明猪肉肌球蛋白在不同pH 值下热聚集形成机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪通脊肉：北京资源亚太食品有限公司，猪宰杀后立即取样液氮冷冻，于-80 ℃冻藏备用。

蛋白Marker （#26630），美国Thermo 公司；ATP·Na2、Tris、EDTA、EGTA 等，均购于美国Amresco 公司；氯化钾、焦磷酸钠、氯化镁、氯化钾等，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Prometheus NT.48 差示荧光扫描仪，美国Quantum Design 公司；HT7700 透射电子显微镜，日本日立公司；Zetasizer Nano ZS 纳米粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；显微激光共聚焦拉曼光谱仪（LabRam HR800），法国 HORIBA JobinYvon 公司；UV-2102PC 紫外可见分光光度计，上海UNICO 公司；DELTA 320 酸度计，瑞士梅特勒-托利多公司；酶标仪（Tecan M200 PRO），瑞士Tecan 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

1.3.1.1 提取肌球蛋白 取刚宰杀后猪的通脊肉，剔除脂肪和结缔组织，绞碎，用液氮速冻，之后放于-80 ℃冰箱贮存备用。肌球蛋白的解离纯化参照Han 等[14]的方法，并进行改进。所有提取步骤均在4 ℃条件下进行。取100 g 肉样，放于5 倍体积溶液A （0.1 mol/L Tris-HCl pH=7，20 mmol/L EDTA）中匀浆10 min，离心（3 000 g，10 min）。取沉淀溶于3 倍体积“Hasselbach-Schneider”（H-S）[15]溶液（0.4 mol/L KCl，0.1 mol/L KH2PO4/K2HPO4，10 mmol/L Na4P2O7，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EGTA，pH 6.4） 中，匀浆20 min，离心 （5 000 g，10 min）。取上清，加入9 倍体积预冷超纯水稀释，过夜沉降。虹吸出上清部分，余下部分离心（12 000 g，12 min）。取沉淀，加入3 倍体积溶液B（0.1 mol/L KCl，pH 7.0），搅拌提取，离心（1 500 g，10 min）。取沉淀，加入溶液C （0.6 mol/L KCl，0.15 mol/L KH2PO4/K2HPO4，5 mmol/L Na4P2O7，5 mmol/L Mg Cl2，1 mmol/L EGTA，2 mmol/L ATP·Na2，pH 6.5），搅拌提取30 min。

随后，缓慢加入经充分碾磨的硫酸铵固体使其质量分数达到35%，离心（10 000 g，25 min），取上清；在上清中加入经充分碾磨的硫酸铵固体使其质量分数达到48%，继续搅拌10 min，离心（10 000 g，25 min），取沉淀。所得沉淀即为肌球蛋白沉淀。

1.3.1.2 pH 值对肌球蛋白热聚集行为影响的样品制备 将所得肌球蛋白沉淀溶于0.02 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 6.5）中，并以此缓冲液作为透析液透析24 h，中间透析液更换两次。将透析所得蛋白溶液体积七等分（V/V），各组均加入氯化钠使蛋白溶液中氯化钠浓度均为0.6 mol/L，之后将各组pH 值分别调为5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，同时配置含有0.6 mol/L 氯化钠浓度和相应pH 值的0.02 mol/L Tris-HCl 缓冲液，将蛋白溶液中蛋白质量浓度调至20 mg/mL，放于0～4 ℃贮藏，1 周内完成指标测定。

1.3.2 SDS-PAGE 蛋白电泳 参照Laemmli[16]的方法，分离胶聚丙烯酰胺体积分数为12.5%，浓缩胶聚丙烯酰胺体积分数为4%。蛋白质量浓度1 mg/mL，与5×上样缓冲液4∶1 混合，沸水浴5 min，上样量20 μL。初始电压80 V，待样品进入分离胶后调整电压为120 V。电泳结束，利用考马斯亮蓝R-250 进行染色，醋酸-甲醇溶液进行脱色。利用扫描仪扫胶，对条带进行分析。

1.3.3 浊度的测定 参考Xiong 等[17]的方法，将蛋白溶液稀释到2 mg/mL，由20 ℃升温至80 ℃，每10 ℃收集样品1 次，以其320 nm 处的吸光值来表示蛋白质溶液的浊度。每个样品测定3 次平行，取平均值。

1.3.4 粒径的测定[18]将蛋白溶液稀释到0.5 mg/mL，由20 ℃升温至80 ℃，每10 ℃收集样品1次，放于1 cm 光程的石英比色皿中，散射角为173°。将样品放入纳米粒度分析仪，采用He-Ne激光在633 nm 波长条件下进行测定，并用仪器自带软件进行数据分析。每个样品测定3 次平行，取平均值。

1.3.5 变性率的测定[19]将蛋白溶液稀释到5 mg/mL，分别置于30，40，50，60，70，80 ℃条件下水浴加热1，2，5，10，20，30 min，取出后迅速冰浴放于4 ℃贮藏。取热处理后的样品10 000 r/min 离心10 min，取上清，测定上清中蛋白浓度，每个样品测定3 次平行，取平均值。肌球蛋白热变性率计算公式如下：

变性率=（热处理前溶液中蛋白质量-热处理后样品上清中蛋白质量）/热处理前溶液中蛋白质量×100%

1.3.6 蛋白结构稳定性分析[20]利用差示荧光扫描仪进行蛋白结构稳定性的测定，将蛋白溶液稀释到0.5 mg/mL，各组样品10 μL 吸入毛细管进行测定，温度范围20～80 ℃，升温速率1 ℃/min，测定升温过程中蛋白溶液F350nm/F330nm的变化，利用仪器自带软件分析蛋白升温过程中变性温度Tm。

1.3.7 Ca2+-ATP 酶活的测定 参照Benjakul 等[21]和Xu 等[22]的方法，略做修改。将蛋白溶液调至4 mg/mL，分别选取4，20，30，40，50，60，70 ℃进行样品收集，按照表1配制反应混合液，配制时先将除ATP 以外的溶液加入混匀，将反应混合液放于25℃水浴锅中恒温。之后加入ATP 溶液，立即开始计时。反应进行3 min，加入2 mL 15% TCA 终止反应，之后10 000 g 离心2 min，取上清。空白组首先加入TCA，之后加入ATP。吸取4 mL 上清液，分别加入3 mL 0.05 mol/L Tris-马来酸缓冲液（pH 7.0），振荡混匀，之后加入3 mL 定磷试剂（20%VC，3 mmol/L H2SO4，3%钼酸铵以等体积混合），放于45 ℃水浴锅中恒温30 min，取出冷却，测定各组溶液640 nm 波长处吸光值。每个样品测定3次平行，取平均值。

表1 反应混合液的配制组成Table 1 Components of mixed reaction solution

Ca2+-ATP 酶活性表示为1 mg 酶蛋白在1 min 内生成的无机磷酸量（μmol）。计算公式如下：

Ca2+-ATP 酶活性=0.0132 C 磷酸 μmol/mg/min

1.3.8 肌球蛋白聚集体的形态观察[16]利用负染透射电镜技术观察蛋白聚集体形态。将蛋白溶液稀释到0.5 mg/mL，用于负染透射电镜的样品制备。吸取5 μL 热处理后蛋白样品滴于镀碳膜铜网，静置1 min，之后超纯水冲洗3 次，滤纸吸干。吸取3.5 μL 醋酸铀染液滴于铜网，预染两次，滤纸吸干，之后染色45 s，滤纸吸干，烘干后可用于透射电镜观察（加速电压：80 kV）。

1.4 数据分析

结果表示为平均数±标准差。统计分析均采用版本为17.0 的SPSS 软件进行（SPSS In.，Chicago，IL）。各组间的数值用ANOVA 和Duncan 多重比较分析，当P<0.05 认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 肌球蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱观察

通过硫酸铵分级沉淀的方法对粗肌球蛋白溶液进一步纯化，以去除溶液中所含的肌动蛋白、肌钙蛋白等其它盐溶蛋白，纯化后肌球蛋白SDSPAGE 电泳图谱如图1所示。由图可知，粗肌球蛋白经过硫酸铵分级沉淀后纯度得到提高。在电泳过程中，肌球蛋白变性被分解为4 种亚基，分别为肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链2和肌球蛋白轻链3，实现肌球蛋白充分解离的效果。

图1 纯化后所得的肌球蛋白SDS-PAGE 图谱Fig.1 SDS-PAGE of myosin after purification

2.2 肌球蛋白热聚集过程中浊度的改变

pH 值对肌球蛋白加热过程中浊度的影响如图2所示。在20 ℃时，pH 值并未对肌球蛋白浊度值产生显著影响（P>0.05）。但是随着温度升高，各处理组间差异逐渐显著。其中，pH 5.5 处理组中肌球蛋白浊度值在40 ℃时即出现显著升高（P<0.05）。pH 6 和6.5 处理组中肌球蛋白浊度值在50 ℃出现显著升高（P<0.05），pH 7 处理组中肌球蛋白浊度值在70 ℃出现显著升高。但是pH 7.5，8和8.5 处理组中肌球蛋白浊度在升温过程中未发生显著升高现象，此3 个处理组肌球蛋白浊度值随着温度升高均呈缓慢上升趋势。当温度达到80 ℃时，pH 5.5，6 和6.5 处理组中肌球蛋白浊度值显著高于其它处理组（P<0.05），3 组之间无显著差异（P>0.05）。pH 7.5，8 和8.5 处理组中肌球蛋白浊度在80 ℃时，显著低于其它处理组（P<0.05），3 组间无显著差异（P>0.05）。

图2 不同pH 值条件下肌球蛋白加热过程中浊度的改变Fig.2 Effects of pH on turbility of porcine myosin during heating

2.3 肌球蛋白聚集体的粒度表征

pH 值对肌球蛋白加热过程中粒径的影响如图3所示。研究发现，初始温度时，pH 5.5 处理组粒径值高于其它处理组，但未出现显著差异（P>0.05）。随着温度升高，各处理组粒径值均逐步升高，其中pH 5.5，6 和6.5 处理组平均粒径在温度40～60 ℃时升高显著，pH 7，7.5，8 和8.5 处理组平均粒径则在温度50～60 ℃时升高显著 （P<0.05）。当温度70～80 ℃时，pH 8 和8.5 处理组平均粒径无显著变化，平均粒径为730～760 nm，显著低于其它处理组（P<0.05）；其它处理组仍逐步升高，其中pH 6.5，7 和7.5 处理组平均粒径为940～1 000 nm，pH 5.5 和6 处理组平均粒径为1 200～1 300 nm，显著高于其它处理组（P<0.05）。

图3 不同pH 值条件下肌球蛋白加热过程中粒径的改变Fig.3 Effects of pH on particle size of porcine myosin during heating

2.4 肌球蛋白热变性率分析

分别选取pH 5.5 和pH 8.5 处理组进行肌球蛋白热变性动力学分析。

pH 值对肌球蛋白加热过程中变形率的影响如图4所示。pH 5.5 条件下，不同温度处理组随着加热时间的延长，肌球蛋白变性率逐渐升高。其中，80 ℃条件下，加热时间达到2 min，肌球蛋白变性率即达到80%，蛋白变性率升高速率高于pH 6.5 处理组。加热温度70 ℃和80 ℃条件下，加热时间达到20 min，肌球蛋白变性率均接近100%。加热温度30 ℃和40 ℃处理组，当加热时间达到10 min 后，蛋白变性率升高速率高于pH 6.5 处理组。pH 8.5 条件下，加热温度70 ℃与80 ℃条件下，加热时间达到30 min，肌球蛋白变性率才升至90%以上。加热温度60 ℃条件下，加热时间达到30 min，肌球蛋白变性率为48.12%，显著低于其它pH 值处理组（P<0.05）。pH 8.5 条件下，肌球蛋白变性率升高速率显著低于pH 5.5 与pH 6.5 处理组（P<0.05）。因此，随着pH 值的升高，肌球蛋白变性速率逐渐降低。

图4 不同pH 值下热处理对肌球蛋白变性率的影响Fig.4 Effects of heat treatment on denaturation rate of porcine myosin with different pH values

2.5 肌球蛋白热聚集过程中蛋白结构稳定性分析

从图5和表2可知，随着pH 值的升高，肌球蛋白变性温度Tm1与Tm2均呈升高趋势。其中，当蛋白溶液pH 值由5.5 升至8.5 时，Tm1由39.2 ℃升至44.9 ℃，当蛋白溶液pH 值由5.5 升至8.5时，Tm2由52.2 ℃升至54.9 ℃，Tm2变化程度低于Tm1。由此说明，pH 值的升高延缓了肌球蛋白两个结构域解折叠行为的发生，肌球蛋白的结构热稳定性得到提高，但是，pH 7.5，8 以及8.5 3 个处理组之间，肌球蛋白变性温度Tm1与Tm2无显著差异，说明pH 值进一步提高对肌球蛋白结构热稳定性无显著影响。

图5 不同pH 值条件下肌球蛋白荧光曲线图（a）及其一阶导数图（b）Fig.5 Differential scanning fluorimetr （DSF） curve of porcine myosin （a） and the first derivative of the DSF curve （b） at different pH values

表2 pH 值对肌球蛋白变性温度Tm 的影响Table 2 Effects of pH on the thermal denaturation temperature of porcine myosin

2.6 肌球蛋白热聚集过程中Ca2+-ATP 酶活的变化

Ca2+-ATP 酶活性位点位于肌球蛋白头部，主要用来判断肌球蛋白聚集过程中头部结构完整性及头部参与蛋白聚集行为的程度[23-25]。如图6所示，pH 5.5 条件下，肌球蛋白Ca2+-ATP 酶活性显著低于其它处理组，由于pH 5.5 接近肌球蛋白等电点，在处理过程中容易引起肌球蛋白的变性，当加热温度到达40 ℃时，Ca2+-ATP 酶活性降为0，因此，肌球蛋白Ca2+-ATP 酶活性最低。初始温度4 ℃时，随着pH 值的升高，Ca2+-ATP 酶活性逐渐降低，pH 8.5 时Ca2+-ATP 酶低于其它处理组。随着加热温度的升高，Ca2+-ATP 酶活性逐渐降低，当温度达到50 ℃时，pH 6 和6.5 处理组Ca2+-ATP酶活性降为0，当温度达到60 ℃时，pH 7，7.5，8和8.5 处理组Ca2+-ATP 酶活性降为0。其中，温度30～40 ℃时，pH 6 和6.5 处理组Ca2+-ATP 酶活性下降速率高于pH 8 和8.5 处理组。因此，随着pH值的升高，Ca2+-ATP 酶失活速率逐渐降低，失活温度逐渐提高，说明蛋白溶液pH 值的升高导致肌球蛋白头部结构解折叠行为发生缓慢，分子间聚集速率降低。

图6 pH 值对肌球蛋白热变性的Ca2+-ATP 酶活性影响Fig.6 Effects of pH on Ca2+-ATPase activity of porcine myosin during heating

2.7 肌球蛋白聚集体的形态观察

根据不同处理组间蛋白粒径及蛋白结构稳定性的差异，选取具有代表性的pH 值5.5，8.5，分别在20，50，80 ℃3 个处理温度条件下，对蛋白聚集体的形态进行观察。

图7 不同pH 值条件下热处理过程中肌球蛋白的透射电镜图（×200 000）Fig.7 Transmission electron microscope of myosin with different pH values during heating

从上图可知，在同一pH 值条件下，随着温度的升高，蛋白逐渐聚集。pH 5.5 处理组中，在20℃时，肌球蛋白分散于盐溶液中，蛋白之间未发生聚集现象，温度达到50 ℃时，蛋白互相聚集，形成小的聚集体，但是对比发现，聚集体周围无明显向外散射的肌球蛋白尾部，当温度达到80 ℃时，蛋白进一步聚集，但是聚集体结构较松散，呈颗粒状聚集状态。pH 8.5 处理组中，在20 ℃时，肌球蛋白分散于盐溶液中，蛋白之间未发生聚集现象，与pH 5.5 处理组无显著差异，当温度达到50 ℃时，蛋白互相聚集，部分聚集体之间通过肌球蛋白尾部互相连结，当温度达到80 ℃时，蛋白进一步聚集，聚集体之间蛋白尾部结合明显，蛋白之间聚集充分。

3 结论

本文研究了不同pH 值对肌球蛋白热聚集行为的影响。研究发现，pH 值由5.5 升高至8.5，蛋白变性温度由40.2 ℃降至36.9 ℃，Ca2+-ATP 酶失活温度由40 ℃升至60 ℃，电镜观察发现蛋白聚集体之间交联程度显著增加。此外，pH 5.5 的条件下，由于接近蛋白等电点，肌球蛋白在初始温度下即容易互相碰撞聚集，但是由于蛋白结构未充分展开，分子间疏水性相互作用较弱，蛋白虽然快速聚集在一起，但是聚集体结构较为松散，形成颗粒状聚集体。随着pH 值的升高，由于蛋白之间静电斥力的作用，使得蛋白聚集速率降低，加热过程中蛋白变性，结构充分展开，疏水基团暴露度高，分子间疏水性相互作用强烈，分子之间有序聚集。本研究阐明了猪肉肌球蛋白热聚集形成机制，为解析其它纤维状蛋白质聚集机制提供了理论基础，对指导肉制品工业生产具有重要的实际意义。