兔坐骨神经急性挤压伤模型的建立及扩散峰度成像的b值优选

梁晓韵，万 齐，余煜栋，彭 玉，陈智杰，李新春广州医科大学附属中医医院放射科，广东 广州 50000；广州医科大学附属第一医院放射科，广东 广州500

周围神经损伤是导致严重运动障碍的重要健康问题［1］。由于人体研究病理取材的限制，动物模型的建立对周围神经损伤修复的研究具有重要意义。目前周围神经挤压伤动物模型的制作方法多种［2］，其中用于MRI评估的周围神经挤压伤动物模型亦不少，但现有的挤压伤模型损伤段神经多较短，使用MRI监测时只能评估挤压伤远端的神经改变，而未能直接反映挤压段的磁共振信号变化［3］。本研究尝试使用自制扁嘴钳，模拟人体周围神经损伤机制，以期制作适合MRI直接监测的兔坐骨神经急性挤压伤模型。扩散峰度成像（DKI）是反映组织内非高斯分布水分子扩散情况的功能成像方法，在中枢神经系统已有较多地应用研究，但在周围神经创伤评估方面研究尚少［4-5］。在中枢系统中，DKI的最高b值至少需要2000 s/mm2，而在体部应用则至少需要1500 s/mm2［6］；然而哪个b值组合更适合于周围神经成像目前尚未见报道。本研究拟基于建立的动物模型，对周围神经DKI成像b值的优选进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康新西兰大白兔27只（清洁级，由广东省动物实验中心提供），雌雄不限，体质量1.8～2.3 kg。选取右后肢作为损伤侧，建立坐骨神经损伤与修复模型，左侧为假手术侧。实验方案经广州医科大学动物实验伦理委员会批准。

1.2 模型制作

速眠新肌注诱导麻醉后，经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉，常规消毒备皮。右侧为实验侧，左侧为对照侧。实验兔取左侧卧位，在无菌操作下于右侧大腿上段沿股骨背侧长轴纵向切口约2 cm，钝性分离股二头肌与股直肌及内收长肌间隙，暴露坐骨神经，速眠新滴注于神经上局部麻醉，合上血管钳轻轻提起坐骨神经远端，用自制扁嘴钳，钳嘴宽约8 mm，夹持坐骨神经30 s，钳夹力约54 N，可见神经纤细变薄但未离断，然后以丝线分层缝合切口。左侧大腿相同部位行假手术，以相同方式暴露坐骨神经并滴注速眠新局部麻醉后直接缝合创口（图1）。

图1 兔坐骨神经急性挤压伤模型制作Fig.1 Establishment of rabbit model of acute sciatic nerve crush injury.

1.3 磁共振扫描

采用超导型3.0 T TX 多源磁共振设备（Philips，Achieva）及兔专用线圈，分别于术前、1 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周行MRI扫描，观察损伤段神经及周围肌肉的信号改变。扫描序列包括：T2WI/SPAIR：TR 3000 ms，TE 66 ms，NSA=2，层厚2 mm，采集矩阵172×137，重建矩阵528×528，FOV 120×120。DKI1500：TR 1158 ms，TE 115 ms。层厚/层间距：2 mm/0 mm，b=0、750、1500 s/mm2，扩散编码方向medium（15方向），FOV 120 mm×120 mm，采集矩阵80×79，体素1.4 mm×1.4 mm。DKI2000：b=0、1000、2000 s/mm2，余成像参数与DKI1500一致。

1.4 病理检查

于各时间点随机选取2只兔子，使用过量麻醉将兔处死并解剖兔的下肢。兔取侧卧位双大腿屈曲，取股骨下横向切口为入口，沿肌间隙钝性分离，暴露、游离坐骨神经，取损伤段神经一段立即置于4%戊二醛磷酸缓冲液中预固定，l%四氧化锇后固定，系列乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片机切半薄切片定位，再切超薄切片，片厚50 nm，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，用Hitachi H-600电子显微镜观察。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用重复测量资料的单因素方差分析方法，分析损伤侧与对照侧神经各时间点DKI参数。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 坐骨神经挤压伤后神经大体观察

损伤后1 d，神经损伤段变扁，扭曲，弹性减低，神经表面充血，损伤后3 d～2周，神经损伤段不同程度肿胀，与邻近肌肉黏连，神经表面淤血逐渐减少。损伤后4～8周，神经损伤段仍肿胀，程度稍减轻，与邻近肌肉不同程度黏连。

2.2 电镜改变

正常神经髓鞘结构完整，髓鞘呈层板状，轴索排列整齐，走行平直、分布均匀。损伤后第1天、第3天，有髓神经呈脱髓鞘状的洋葱皮样改变，轴索轻度萎缩，可见大量神经微丝，线粒体肿胀、空化。施万细胞胞质可见溶酶体，同时可见大量自噬体形成，可见核染色质凝集、边集。损伤后第1周、第2周，有髓神经结构较前改善，髓鞘轻度皱缩，轴索可见大量神经微丝，部分轴索轻度萎缩，可见少量蜂窝状结构形成，周围见少量新生薄髓神经。损伤后第4周，轴索开始增生,雪旺细胞开始增生，并可见神经外膜与神经束膜之间炎症细胞浸润减少。损伤后第6周，髓鞘逐渐增厚,髓鞘菲薄且不均匀，再生轴索较前明显并成熟，雪旺细胞广泛增生，板层结构稍紊乱，周围大量新生薄髓纤维。损伤后第8周，轴索密度、直径较前增加，髓鞘明显较前增厚，板层结构逐渐恢复接近正常，厚薄欠均匀。

2.3 DKI1500及DKI2000各参数值变化

DKI2000与DKI1500在各参数的总体变化趋势基本一致。FA值（图2）：损伤后第1天损伤侧和假手术侧坐骨神经FA值明显下降，以损伤侧明显；损伤后第3天～第8周持续上升，其中假手术侧的FA值上升较损伤侧快，FA1500及FA2000于各时间点的组间差异均有统计学差异（P=0.001、0.004、<0.001；P=0.001、<0.001，表1）。

图2 损伤前后兔坐骨神经DKI2000序列FA图Fig.2 Rabbit sciatic nerve on FA map of DKI2000 before and after crush injury.

表1 DKI2000与DKI1500序列坐骨神经FA值比较Tab.1 Comparison of FA values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

双侧神经MK值在第1天均明显下降，此后开始缓慢、曲折上升的趋势，双侧MK1500值在术后第2周（P=0.022）、第4周（P=0.018）、第6周（P=0.016）及第8周（P=0.016）差异有统计学意义。而MK2000仅在第4周组间差异有统计学意义（P=0.002，表2）。

表2 DKI2000与DKI1500序列坐骨神经MK值比较Tab.2 Comparison of MK values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

RK值在第1天明显下降，其后各时间点RK值波动较大，RK1500与RK2000均在第6周双侧神经组间差异具有统计学意义（P=0.018、0.039，表3）。AK值双侧神经于各时间点组间差异均无统计学意义（P>0.05，表4）。

表3 DKI2000与DKI1500序列坐骨神经RK值比较Tab.3 Comparison of RK values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

表4 DKI2000与DKI1500序列坐骨神经AK值比较Tab.4 Comparison of AK values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

3 讨论

周围神经挤压伤动物模型的制作方法较多，以钳夹方式较为多见［2］；但若使所制作的模型适合MRI监测，则需要损伤段的神经具有一定的长度［7］。有研究利用无齿微血管钳制作兔坐骨神经急性挤压伤模型进行MRI研究［8］，但由于损伤段神经较短，只能对损伤段远端神经进行MRI定量监测。也有学者使用丝线结扎坐骨神经制作挤压伤，损伤段神经仍然较短，故MRI只能监测损伤段远端神经［9］；Sun等［3］用有齿持针钳钳至一扣约3.6 kg钳夹，钳夹范围约3 mm，但仍不足以满足MRI监测的需要，而只能对损伤段以远神经进行评估；Luis等［10］采用自制的无齿钳制作挤压大鼠坐骨神经挤压伤模型进行形态及功能的研究，其产生的钳夹力恒定为54 N，钳夹范围宽约3 mm。李登科等［11］用螺旋测微仪卡口挤压坐骨神经，挤压神经厚度至0.15 cm，停留时间为60 s，坐骨神经损伤长度为5 mm。此模型损伤段较宽，但因其螺旋杆在对神经进行挤压的同时容易引起坐骨神经扭转，额外增加横向旋转的剪切力，导致神经牵拉伤或拉断神经纤维。针对以上问题，本研究采用较宽的扁嘴钳挤压装置，挤压伤段神经长度约1 cm，制作坐骨神经急性挤压伤模型。钳夹后肉眼可见钳夹处神经明显变薄呈半透明状，经病理检查证实损伤段神经发生wallerian变性，髓鞘及轴突崩解，表明本研究成功制作了坐骨神经挤压伤模型。

本实验在第4周时可见新生轴索形成，与既往文献略有不同，考虑为损伤的严重程度及病理取材部位不同所致。有学者制作的大鼠坐骨神经挤压伤模型分别在术后2周和3周即出现轴索再生［9,12］，可能是由于所用装置钳夹力较小及钳夹范围较短，故神经再生时间相对较早；Sun等［3］制作的兔坐骨神经挤压伤模型在术后第6周出现轴索再生，这可能是由于其使用有齿钳制作模型，造成的神经损伤更为明显，且病理取材部位为神经损伤远端所致。

既往周围神经损伤成像评估以DTI多见［13］；DKI在周围神经损伤应用较少，且多以视、听神经为主［14］。本研究尝试使用最高b值为1500 s/mm2及2000 s/mm2的不同组合对坐骨神经进行DKI 成像，发现DKI1500与DKI2000各参数的变化趋势相似；损伤后FA值降低可能与神经局部炎性反应及水肿，导致周围神经水分子扩散各向异性降低相关，FA值升高可能与损伤后的微丝、微管、施万细胞的增殖、水肿消退及神经再生导致神经各向异性增高有关；这与之前DTI评估周围神经损伤的研究［15-16］类似。MK值术后第1天下降，此后开始缓慢、曲折上升；DKI1500中损伤侧与假手术侧MK值在第2～8周时差异有统计学意义，而DKI2000序列中两侧MK值仅在第2周时差异有统计学意义，说明DKI1500可能更适于周围神经成像评估。另一方面，DKI1500与DKI2000两个序列的RK值、AK值在各时间的组间差异无统计学意义，且各组数据标准差较大，这可能是由于DKI序列中应用的最高b值较大时高b值弥散图像的噪音对参数计算产生影响［17］；且兔坐骨神经较为细小，对噪声的影响较为敏感所致。b值越大，图像的信噪比越差，从这个角度来说，DKI1500由于使用更小的b值，也更适合于周围神经的成像与评估。

综上所述，本研究利用自制扁嘴钳挤压装置，成功制作坐骨神经急性挤压伤模型。本模型便于使用MRI对神经损伤与再生进行动态监测，同时也方便使用定量MRI技术对挤压伤段神经进行直接测量。DKI可用于周围神经的评估，DKI周围神经成像最大b值取1500 s/mm2可能较2000 s/mm2更为合适。