非整倍体筛查周期中发生早期妊娠丢失的影响因素分析

范英英，李蕾，李净羽，王雪，张翠莲

(郑州大学人民医院 河南省人民医院 河南省生殖医院，郑州 450003)

在辅助生殖技术中，有大型数据显示妊娠丢失率可高达18.3%[1]，其中早期妊娠丢失占50%以上[2]，早期妊娠丢失会增加患者的身体、心理以及经济负担[3]。目前临床对早期妊娠丢失也有较多的研究，有文献报道早期妊娠丢失与子宫畸形、高龄、体质量指数(BMI)、既往流产史、多囊卵巢综合征(PCOS)、胚胎染色体异常等多因素有关[4-6]，其中以胚胎染色体异常为主要因素[4]。Murugappan等[7]发现胚胎植入前遗传学检测-非整倍筛查(PGT-A)周期中的流产率显著低于常规IVF/ICSI周期。但在临床工作中我们观察到，经过胚胎筛选正常后植入的PGT-A患者仍有早期妊娠丢失发生，其原因不明，相关文献报道较少。本文主要对此进行相关探讨。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1月至2020年6月于河南省人民医院生殖中心行PGT-A周期的患者。纳入/排除标准：行PGT-A周期后获得可利用囊胚且冻融移植后获得妊娠的患者；排除诊断为先天性或后天子宫畸形，或有明确影响胚胎着床的其他因素如输卵管积水、宫腔粘连史等患者。

本研究共纳入214个周期。根据最终是否持续妊娠分为持续妊娠组(n=187)和早期妊娠丢失组(n=27)。

二、研究方法

1.促排卵方案：卵巢刺激方案主要包括早卵泡期长效长方案、黄体中期短效长方案、拮抗剂方案、高孕激素状态下促排卵治疗(PPOS)方案及微刺激方案，按照我中心ICSI常规进行。

2.胚胎检测：采用滋养外胚层细胞活检(TEB)，抽吸5～10个细胞送检，筛选出染色体正常可移植的囊胚。

3.冻融胚胎移植(FET)周期内膜准备：(1)自然周期，在优势卵泡排卵后第5日移植囊胚。(2)激素替代周期：月经第2～4日给予补佳乐(拜耳，法国)每日4～6 mg，后根据子宫内膜厚度调整其用量，最大剂量为每日8 mg。取卵周期HCG注射日内膜厚度≥7 mm时，达芙通(苏威，荷兰)口服每日20 mg联合雪诺同(默克雪兰诺，德国)阴道给药每日90 mg转化内膜，转化内膜后第6日进行囊胚移植。(3)降调节后激素替代周期：于月经周期第2～4日给予长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达菲林，默克雪兰诺，德国)3.75 mg肌肉注射，注射后第14日，当达到降调标准时给予补佳乐，适时转化内膜，转化后第6日进行囊胚移植。

4.黄体支持：胚胎移植后维持内膜转化时雌、孕激素用药不变，直到移植后14 d查血β-HCG，若≥25 U/L，继续用药至超声检查到胎心后开始逐渐减量至孕10周停药。

5.妊娠判断：以移植术后4周阴道B超示子宫内外有妊娠囊者为临床妊娠；发生在12周以内的流产定义为早期流产；胚胎移植后14 d血β-HCG≥25 U/L，但B超未见妊娠孕囊者为生化妊娠。早期妊娠丢失包括早期流产和生化妊娠；早期妊娠丢失率=(早期流产周期数+生化妊娠周期数)/妊娠周期数×100%。

6.囊胚评分：按照Gardner评分系统[8]进行，根据囊腔扩张程度进行分级。囊腔不足胚胎体积的50%为1级；≥50%为2级；囊腔几乎占满整个胚胎为3级；囊腔扩张、透明带变薄为4级；囊胚开始从透明带破口孵出为5级；囊胚完全孵出，脱离透明带为6级。对处于3～6级的囊胚，进一步对内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)进行评分。ICM评分：细胞数量多且分布紧密成团，突起明显为A级；细胞数量较少且分布松散为B级；细胞数量非常少，难以辨别明显的ICM结构则为C级。TE评分：较多的细胞形成连接紧密的上皮层为A级；较少的细胞，上皮样结构不连续，连接松散为B级；细胞少且体积大为C级。4BB及以上囊胚定义为优质囊胚。

三、统计学方法

结 果

一、两组患者基础资料分析

共收集到341个PGT-A周期，FET后共有214个妊娠周期，其中27个周期为早期妊娠丢失，早期妊娠丢失率为12.62%(27/214)。继续妊娠组与早期妊娠丢失组间基础资料及抗β2糖蛋白抗体、抗心磷脂抗体IgM血清学免疫指标比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者基本资料[(-±s)，n(%)]

二、两组患者促排卵及胚胎移植情况分析

持续妊娠组的移植日子宫内膜厚度高于早期妊娠丢失组，差异有统计学意义(P<0.05)，其余指标均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者的促排卵及胚胎移植情况[(-±s)，n(%)]

三、早期妊娠丢失多因素分析

将女方年龄、BMI、孕次、胚胎发育天数、移植日子宫内膜厚度、复发性流产病史纳入多因素分析，结果显示，仅移植日子宫内膜厚度对妊娠结局的影响有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 早期妊娠丢失患者多因素分析

讨 论

染色体异常包括结构异常和数量异常，目前认为早期妊娠丢失中以染色体异常为主要原因，其中染色体非整倍体率异常占大部分[9]。PGT-A周期可筛选出整倍染色体的胚胎。多项研究均指出女性年龄是发生胎儿染色体异常的独立危险因素[10-11]，本研究中移植的都是经过筛选的具有正常的整倍体染色体的胚胎，发现女性的年龄并不影响早期妊娠丢失率，可能是女性年龄影响早期妊娠丢失主要是因为女性年龄影响胎儿的染色体；也有可能是获得妊娠的患者基本情况较好，都较年轻。需要进一步累积样本量。胎儿的染色体还有一半来自父亲，有研究发现男方年龄不会影响胚胎质量及妊娠率，但随着男性年龄的增长，早期流产率增高[12]，原因可能与男性高龄导致胚胎染色体异常相关[13]，本研究中发现男方年龄对早期妊娠丢失率无影响，同样可能与本研究中男性都偏年轻有关。

本研究在对移植的胚胎质量及胚胎发育天数进行讨论发现，早期妊娠丢失与持续妊娠组中优质胚胎占比(37.04% vs. 39.04%)、D5胚胎占比(55.56% vs. 54.01%)无显著差异。有研究结果提示移植D5的优质囊胚的临床结局较D6者更好，考虑可能与D6囊胚中非整倍体率相较于D5囊胚增加有关[14-15]，而本研究中移植的都是经过整倍性筛选的胚胎。成功的妊娠不仅需要好的胚胎，同时需要合适的子宫内膜。当子宫内膜厚度保持在8.7～14.5 mm范围内时，可获得最佳的活产率；如果子宫内膜太薄或太厚，活产率将降低。也有研究指出内膜厚度大于14 mm后，异位妊娠的发生会升高[16-17]。本研究中早期妊娠丢失组的子宫内膜厚度低于持续妊娠组(9.59 mm vs. 9.73 mm)，差异具有统计学意义(P<0.05)，是早期妊娠丢失的影响因素。目前也有研究报道发现子宫内膜厚度及胚胎植入的深度也可作为ART成功的预测指标[18-19]，这些指标对于早期妊娠的丢失是否有影响，还有待进一步的研究。

既往研究指出随着流产次数的增加，再发流产的风险升高[20]。但既往流产次数与胚胎染色体异常是否相关仍存在争议。一项均移植整倍体胚胎的研究显示，流产史与持续妊娠、妊娠丢失无关[21]。本研究中两组患者间的复发流产史占比也无显著性差异，结果与上述研究一致。从另一个角度分析，随着孕次和流产次数的增加，会对子宫内膜造成一定的损伤从而导致早期妊娠丢失。本研究中未显示孕次对早期妊娠丢失产生影响，可能的原因是本研究样本量比较小，且平均孕次为(1.74±1.81)，孕次相对较少。确切证据还需大样本的数据进行研究探讨。

肥胖是指BMI>28 kg/m2，肥胖可通过影响患者的体内的脂肪酸含量及卵子卵泡液的环境，从而影响ART助孕的临床结局[22-23]。但也有研究指出，肥胖及超重在冻融胚胎移植周期中不会增加流产的风险[24]。本研究中移植的胚胎都经过筛选，且本研究中患者的BMI都相对较低，结果发现BMI对早期妊娠的流产率无显著影响，与上述结论相一致。肥胖患者中PCOS的发病率也较高，PCOS是影响育龄妇女最常见的内分泌疾病之一，PCOS患者的流产风险仍在争论之中。本研究未发现持续妊娠组与早期妊娠丢失组PCOS患者占比有显著差异，与徐丽清等[9]研究结果相一致。

生殖免疫重要的筛查指标包括抗β2糖蛋白抗体以及抗心磷脂抗体等。近年来研究显示，抗β2糖蛋白抗体与复发性流产有关[25]。抗心磷脂抗体是一种凝血活性物质，可影响子宫内膜的血供从而引起流产；Zhong等[26]发现抗心磷脂抗体阳性与不良妊娠结局显著相关。但本研究中抗β2糖蛋白抗体和抗心磷脂抗体在持续妊娠组和早期妊娠丢失组间阳性占比未见显著差异，这可能与本研究中抗β2糖蛋白抗体和抗心磷脂抗体阳性者均已接受治疗有关。

综上所述，本研究从临床实际问题出发，对经过PGT-A胚胎筛选正常后植入却仍发生早期妊娠丢失的患者做了相关的统计分析，表明移植日子宫内膜厚度是PGT-A周期中早期妊娠丢失的影响因素。但本研究还存在以下局限：样本量小；流产的胚胎并未全部做流产组织检测，PGT-A检测正常的胚胎仍然存在嵌合体的可能。PGT-A的应用在谨慎的原则下越来越广泛，影响其胚胎早期丢失的原因仍需进一步明确以指导临床。