安罗替尼联合氯喹促进人非小细胞肺癌细胞系H1299凋亡

刘细帮，朱林芝，焦德敏，唐夏莉，陈 君，胡旭钢，陈清勇*

(1.温州医科大学 第一临床医学院， 浙江 温州 325000；2.中国人民解放军联勤保障部队第903医院 呼吸与危重症医学科，浙江 杭州 310000)

肺癌(lung cancer)是所有癌中病死率最高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的85%。目前NSCLC的治疗进入个体化治疗和精准治疗的时代，然而预后仍然很差，5年生存率不足20%[1-2]。

安罗替尼(anlotinib)是新型口服酪氨酸多激酶抑制剂，通过抑制多种促血管生成信号[vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)、platelet-derived growth factor receptor(PDGFR),fibroblast growth factor receptor(FGFR)等]的激活[3]；安罗替尼作为三线治疗方案耐受性良好，改善了中国患者的无进展生存期和总生存期[4]；最新的指南将其写入了三线治疗的Ⅰ类推荐。但安罗替尼对部分NSCLC细胞敏感性较低[5]，细胞实验结果也显示安罗替尼对部分NSCLC细胞的IC50依然很高；因此，如何提高这些NSCLC细胞对安罗替尼的敏感性尚需进一步研究。自噬在癌中的作用是动态的；虽然自噬可抑制正常组织中发生肿瘤，但肿瘤也可依靠自噬促进和维持肿瘤的生长[6]。氯喹(chloroquine，CQ)可抑制恶性肿瘤的自噬及其相关的上下游因子[7]；研究表明，氯喹联合靶向药在胰腺癌中具有显著的协同抗肿瘤活性[8]。为此，本实验通过研究安罗替尼和CQ联合对非小细胞肺癌细胞的抑制作用，探讨其潜在的机制，为NSCLC的临床联合治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

人非小细胞肺癌细胞系H1299(中国科学院上海细胞库)；胎牛血清(Gibco公司)；RPMI-1640培养液(浙江森瑞生物科技公司)；安罗替尼(正大天晴药业公司)；氯喹和兔抗人LC3抗体(Sigma-Aldrich公司)；MTT试剂(武汉博士德生物公司)；结晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；Transwell小室(Corning公司)；兔抗人p62和GAPDH抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：用含10% FBS的RPMI-1640培养液，在37 ℃、5% CO2条件下培养H1299细胞；每2～3 d按1∶3的比例传代1次。

1.2.2 MTT法检测细胞存活率：将细胞培养至对数增殖期后，以每孔3×103个细胞接种于96孔板，常规培养24 h后；加入100 μL含不同浓度的CQ(0、10、20、40和80 μmol /L)及安罗替尼(0、2、4、8、16、32和64 μmol/L)联合或不联合CQ(20 μmol/L)培养基，每个浓度设5个复孔；继续培养24 h后，加入20 μL MTT，继续培养4 h。弃培养液，加入DMSO 150 μL，振荡，使结晶溶解。在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(药物组-调零组)/(对照组-调零组)×100%。

1.2.3 划痕愈合实验检测细胞迁移：将细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度达到80%～90%后，用100 μL移液头垂直于培养板划痕，PBS洗涤，在显微镜下观察、拍照，记为0 h划痕宽度。将细胞分成4组，分别为对照组、CQ组(20 μmol/L)、安罗替尼组(5 μmol/L)和联合组(5 μmol/L安罗替尼+20 μmol/L CQ)，加入无血清培养基，继续培养24 h后在同一观察点测量划痕宽度，计算细胞划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞侵袭：将细胞制成2×108个/L的细胞悬液，向小室内加入200 μL的细胞悬液，按1.2.3所述分组，向24孔板中加入600 μL含各组药物的血清培养基，每个浓度设3个复孔；培养24 h后，取出小室，甲醇固定30 min，结晶紫染色20 min。随机挑选5个视野拍照并计数。侵袭率(%)=药物组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。

1.2.5 Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡：将细胞接种于24孔板，待细胞汇合至60%～70%，将细胞分成4组，分别为对照组、CQ组(20 μmol/L)、安罗替尼组(20 μmol/L)和联合组(20 μmol/L安罗替尼+20 μmol/L CQ)，每个浓度设3个复孔；继续培养24 h后，弃培养液，PBS洗涤，甲醇固定20 min，加入终浓度为5 mg/L Hoechst 33342染液，室温避光反应10 min，弃去染液。在倒置荧光显微镜下观察细胞大小及核形态变化。

1.2.6 Western blot检测相关蛋白水平：按结果4所述的分组处理细胞，培养24 h后提取总蛋白，测定样品蛋白浓度；在细胞总蛋白样品中加入上样缓冲液，沸水使其充分变性。然后用SDS-PAGE分离蛋白，经蛋白转膜、封闭、Ⅰ抗(LC3、p62抗体1∶1 000稀释，GAPDH抗体1∶10 000稀释)及Ⅱ抗孵育杂交后进行ECL反应暗室显影；以GAPDH为内参，采用Image J软件对目的蛋白进行定量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度安罗替尼联合CQ对H1299细胞存活率的影响

不同浓度(0～80 μmol/L)的CQ单药处理24 h后，CQ对H1299细胞的存活率均无明显抑制作用(图1A)。而不同浓度的安罗替尼单药处理后细胞存活率低于对照组，且随浓度的增加，对细胞存活率的抑制作用逐渐增强。两药联合组处理的细胞存活率显著低于单药安罗替尼组(P<0.05)(图1B)；安罗替尼组和联合组的IC50分别为47.84 μmol/L、27.31 μmol/L。

A.effect of CQ on the viability of H1299 cells；B.effect of different concentrations of anlotinib(0,2,4,8,16,32,64 μmol/L) with or without CQ(20 μmol/L) on the viability of H1299 cells；*P<0.05 compared with the anlotinib+CQ group

2.2 安罗替尼联合CQ对H1299细胞迁移和侵袭的影响

对照组、CQ组、安罗替尼组和两药联合组细胞愈合率分别为(29.26±3.46)%、(23.22±1.70)%、(5.00±0.62)%和(1.00±1.93)%；CQ对H1299细胞的愈合率无明显抑制作用；安罗替尼组和联合组处理H1299细胞愈合率均低于对照组(P<0.001)，联合组愈合率相较单药安罗替尼组更低(P<0.001)(图2A)。

对照组、CQ组、安罗替尼组和两药联合组侵袭率分别为(100.00±7.59)%、(101.69±3.35)%、(73.52±3.05)%和(50.85±3.59)%；安罗替尼组、联合组侵袭的H1299细胞均显著少于对照组(P<0.001)；联合组侵袭的细胞显著少于单药安罗替尼组(P<0.001)(图2B)。

A.wound-healing test(×40)；B.transwell assay(×200)

2.3 安罗替尼联合CQ对H1299细胞凋亡的影响

对照组和CQ组无明显凋亡细胞，细胞核染色较浅，呈现均匀弥散的蓝色荧光。而安罗替尼组和联合组均可见凋亡细胞，细胞呈致密浓染的蓝色荧光，核碎裂及核固缩明显，其中联合组更明显，且细胞密度更低(图3)。

A.control；B.CQ；C.anlotinib；D.anlotinib+CQ(×200)

2.4 安罗替尼联合CQ对H1299细胞自噬相关蛋白的影响

与对照组相比，5、10和20 μmol/L安罗替尼组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平明显升高(P<0.05)；5和10 μmol/L安罗替尼处理时p62蛋白表达水平上升，而在20 μmol/L时p62蛋白的表达水平明显下降(P<0.05)(图4A)。

CQ组处理H1299细胞后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。20 μmol/L安罗替尼联合CQ组处理H1299细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平显著高于各单药组(P<0.05)；而20 μmol/L安罗替尼联合CQ组的p62蛋白表达水平明显低于CQ组(P<0.05)(图4B)。

A.effect of anlotinib on autophagy-related proteins；B.effect of anlotinib combined with CQ on autophagy-related proteins；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001 compared with the control group； #P<0.05 compared with the CQ group；△P<0.05 compared with the anlotinib group

3 讨论

安罗替尼目前已被获批三线治疗NSCLC、 晚期软组织肉瘤与晚期小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)的靶向药物[4,9-10]，治疗前景光明。但其IC50和毒副作用相对于一线靶向药物和传统化疗药物等较大[5,11]。因此，降低安罗替尼在非小细胞肺癌治疗中的剂量具有重要意义。本研究显示，相较于单独安罗替尼，其联合CQ更加显著抑制H1299细胞存活率，IC50从47.84 μmol/L下降至27.31 μmol/L，二者具有协同效应；并且本研究结果表明可能与细胞自噬相关。

自噬是体内平衡的一个重要过程，自噬与细胞凋亡密切相关，自噬可以抑制细胞凋亡，但长期激活自噬也会导致细胞凋亡。微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3)是自噬关键调控因子，控制自噬膜生长、自噬物质识别及自噬小体与溶酶体融合过程的主要步骤[12]。自噬底物p62/SQSTM1能够结合Atg8/LC3的衔接蛋白，且p62蛋白的积累认为是自噬清除率不足的指标[13]。本研究显示，安罗替尼使H1299细胞自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平显著升高，而p62蛋白表达水平逐渐下降；自噬抑制剂CQ联合安罗替尼处理使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平增加，同时下调p62蛋白表达水平；证明了在体外安罗替尼可以诱导肺癌细胞自噬，自噬抑制剂CQ联合安罗替尼以自噬激活为主。

CQ抑制溶酶体的酸化和与自噬小体的融合，以防止其在后期自噬过程中的降解，从而抑制自噬进程[14]。在本研究中，CQ抑制H1299细胞的自噬，干扰了细胞的正常自噬过程，使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62表达增加；而安罗替尼可以诱导肺癌细胞自噬，使细胞中发生了抑制自噬和激活自噬之间的矛盾，并反映在细胞存活率上。与单独安罗替尼处理相比，联合治疗不仅在抑制细胞迁移和侵袭方面加强，而且也增强诱导细胞凋亡。

综上所述，安罗替尼联合CQ具有增强对NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移抑制作用，并促进细胞凋亡，其机制可能与细胞自噬有关；本研究为进一步丰富安罗替尼联合CQ的抗肿瘤作用提供了新的实验依据。