羧胺三唑乳清酸盐抑制小鼠胶质瘤细胞系GL261增殖及线粒体能量代谢

黄雨晴，高洪婷，杨黎星，陈秋霞，王钰铖，鞠 瑞，郭 磊

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 药理系，北京 100005)

神经胶质瘤(glioma)是成人中枢神经系统最常见的颅内原发恶性肿瘤，包括星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和混合性胶质瘤。尽管神经胶质瘤的发病率不高，但预后较差。目前用神经胶质瘤的治疗手段主要包括手术切除，辅助化学治疗及辅助放射化学治疗等[1]。替莫唑胺是术后辅助化学治疗的标准一线化学治疗药物，但其存在不良反应和耐药性，使得神经胶质瘤的治疗和预后难以取得理想效果[2]。因此，寻找更有效且不良反应少的药物成为神经胶质瘤治疗的研究重点。

羧胺三唑乳清酸盐(carboxyamidotriazole-orotate, CTO)是羧胺三唑的乳清酸盐形式，羧胺三唑是一种非细胞毒类小分子抗肿瘤化合物，在体内外均有抗肿瘤活性，例如肺癌、卵巢癌、乳腺癌等[3-5]。羧胺三唑的抗肿瘤活性被认为与抑制钙内流以及抑制钙依赖信号、抑制线粒体膜电位、促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生有关[6-7]。前期研究发现，羧胺三唑可以影响多种肿瘤细胞的线粒体呼吸。本研究旨在探索CTO对小鼠胶质瘤细胞系GL261增殖和凋亡的影响，在干扰线粒体能量代谢方面解释其作用机制，为进一步优化CTO治疗神经胶质瘤的疗效提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞系：小鼠胶质瘤细胞系(mouse glioma cell line)GL261(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 药品与试剂：CTO(MCE公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；胎牛血清(Gibco公司)；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；XF Mito Stress Test Kit(Agilent公司)；NAD+/NADH检测试剂盒(BioAssay公司)；ATP检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；活性氧检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 活细胞计数检测细胞增殖：用DMEM高糖培养基进行GL261细胞培养和传代。细胞以1.0×105个/孔接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中。隔天给药，依次做以下分组：对照组(DMSO)；给药组(CTO)，以10、20、40 μmol/L CTO给药。分别培养24、48 h后，收集各组细胞，进行活细胞计数。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期：取对数生长期的GL261细胞接种于6孔板中，2.0×105个/孔，选用20 μmol/L CTO给药，对照组加入等体积 DMSO。药物作用 72 h后收集细胞，PBS洗3次。按照细胞周期试剂盒说明书操作，4 ℃ 避光孵育30 min。用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm。

1.2.3 Annexin V/PI双染色及流式细胞仪检测细胞凋亡：取对数生长期的GL261细胞接种于6孔板中，2.0×105个/孔，隔天给药，依次做以下分组：对照组(DMSO)；给药组(CTO)，以10、20、40 μmol/L CTO给药。药物作用 72 h后收集细胞，PBS洗3次。按照细胞凋亡试剂盒说明书操作，室温避光孵育10 min。用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm。

1.2.4 检测细胞内ROS含量：取对数生长期的GL261细胞接种于6孔板中，2.0×105个/孔，选用20 μmol/L CTO给药，对照组加入等体积 DMSO。药物作用 24 h后，按照1∶4 000用无血清培养液稀释 DCFH-DA，使终浓度为2.5 μ mol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA，加入的体积以能充分盖住细胞为宜。37 ℃细胞培养箱内孵育 20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞，用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm。

1.2.5 Seahorse生物能量实验检测细胞耗氧速率(oxygen consumption rate, OCR)：取对数生长期的GL261细胞接种于24孔细胞板中，6.0×104个/孔，隔天给药，依次做以下分组：对照组(DMSO)；给药组(CTO)，以20 μmol/L CTO给药。药物作用 6 h后，按照XF Mito Stress检测试剂盒的说明书进行操作，使用Seahorse XF分析仪检测。

1.2.6 检测细胞ATP的含量: 取对数生长期的GL261细胞接种于6孔板中，2.0×105个/孔，隔天给药，依次做以下分组：对照组(DMSO)；给药组(CTO)，以10、20、40 μmol/L CTO给药。药物作用 72 h后，按照ATP检测试剂盒的说明书进行操作，使用具有检测化学发光功能的酶标仪检测，计算结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CTO对GL261细胞增殖的影响

在24 h时，与对照组相比，40 μmol/L CTO组细胞存活率明显降低(P<0.05)。在48 h时，与对照组相比，10、20、40 μmol/L CTO组细胞存活率均明显降低(P<0.01或P<0.001)。各给药组细胞存活率呈时间-剂量依赖性(图1)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with DMSO group

2.2 CTO对GL261细胞周期的影响

与对照组相比，20 μmol/L CTO组GL261细胞G1期比例明显降低(P<0.01)，S期比例明显升高(P<0.05)(图2)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with DMSO group

2.3 CTO对GL261细胞凋亡的影响

Annexin-V/PI荧光双染法检测CTO对GL261细胞的凋亡诱导作用，与对照组比较，20、40 μmol/L CTO组早期凋亡的细胞比例均明显增加(P<0.05或P<0.01)，10、20、40 μmol/L CTO组晚期凋亡的细胞比例均明显增加(P<0.05或P<0.01)，并且随着药物浓度的增加，早期和晚期凋亡的细胞比例均有增加的趋势(图3)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with DMSO group in early apoptotic cells; #P<0.05, ##P<0.01 compared with DMSO group in late apoptotic cells

2.4 CTO对GL261细胞生成ROS的影响

与对照组相比，20 μmol/L CTO组GL261细胞生成ROS的量显著增加(P<0.01)(图4)。

*P<0.01 compared with DMSO group

2.5 CTO对GL261细胞线粒体呼吸的影响

在Seahorse生物能量实验中，与对照组相比，20 μmol/L CTO组GL261细胞的OCR降低，其中基础呼吸和最大呼吸都明显降低(P<0.01)，而剩余呼吸能力没有显著变化(图5)。

*P<0.01 compared with DMSO group

2.6 CTO对GL261细胞生成ATP的影响

与对照组相比， 10、 20、 40 μmol/L CTO组GL261细胞生成ATP的量都显著降低(P<0.05或P<0.01)，并随着剂量的增加，生成ATP的量逐渐降低(图6)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with DMSO group

3 讨论

羧胺三唑是由美国国立癌症研究所研究和开发的一种新型抗肿瘤药，属人工合成的小分子化合物，研究证明，合成羧胺三唑的乳清酸盐(CTO)形式可以增加口服生物利用度和增加吸收速率，具有降低毒性的优势[8]。本研究旨在探索CTO在神经胶质瘤中的抗肿瘤作用及其调节线粒体代谢方面的机制，为合用其他代谢调控药物提高其治疗胶质瘤的疗效提供理论基础。

本研究的细胞计数结果显示CTO能抑制GL261细胞增殖，并呈时间-剂量依赖性，细胞周期结果显示CTO通过将GL261细胞周期阻滞于S期来抑制细胞的分裂增殖，细胞凋亡结果显示CTO可以增加GL261早期和晚期凋亡细胞的比例。以上结果提示CTO对胶质瘤细胞的抑制作用是通过抑制增殖和促进凋亡来完成的。ROS是一种寿命短、活性高的分子，细胞内ROS水平过高会激活细胞死亡过程，如细胞凋亡[9]。本研究结果提示CTO能够增加细胞内ROS的含量，从而诱导细胞凋亡。

许多类型的肿瘤细胞都依赖线粒体呼吸，通过氧化磷酸化产生ATP来提供能量维持生长，因此破坏肿瘤细胞的线粒体呼吸从而抑制线粒体产生ATP可以作为一种对抗癌症的有效策略[10]。本实验室前期多项实验结果提示，羧胺三唑可以影响多种肿瘤细胞的线粒体呼吸，下调肿瘤细胞线粒体耗氧[11-12]。为了探究CTO在胶质瘤细胞中是否有同样的作用，本研究检测了CTO对小鼠胶质瘤GL261细胞OCR和产生ATP的影响，结果显示CTO降低GL261细胞的OCR、基础呼吸和最大呼吸，并且呈剂量依赖性地降低GL261细胞的ATP含量。以上结果提示，CTO能够破坏胶质瘤细胞的线粒体呼吸，抑制线粒体中ATP的产生，从而抑制胶质瘤细胞生长。

综上所述，CTO可以抑制小鼠胶质瘤GL261细胞的增殖，通过增加ROS的生成促进其凋亡，并且CTO能够破坏GL261细胞的线粒体呼吸，抑制线粒体中ATP的产生，达到抑制胶质瘤细胞生长的效果。