血流感染大肠埃希菌对多黏菌素耐药机制研究

马强 朱永泽 朱建俊 胡志伟 陈伟

大肠埃希菌属于肠杆菌目埃希菌属，是较为常见的条件致病菌之一。2018年中国CHINET细菌耐药监测结果显示，在血液标本分离病原菌中，大肠埃希菌分离率高居首位，占23%[1]。多黏菌素是一类从芽胞杆菌分离获得的脂肽类抗生素，主要作用于细菌细胞膜的脂多糖。目前，多黏菌素被国际上公认为是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后防线”[2-4]。令人遗憾的是，多黏菌素耐药基因已经出现。2015年11月，我国学者率先报道从人与动物肠杆菌科细菌中分离到了质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1[5]。mcr-1属于磷酸乙醇胺转移酶家族，该基因在细菌表达后可以添加磷酸氨基乙醇至脂质A，导致多黏菌素对细菌脂多糖亲和力降低，从而介导菌株对多黏菌素耐药。本研究对两家不同医院分离的血流感染大肠埃希菌耐药性进行分析，并探讨其对多黏菌素的耐药机制，为临床用药及治疗提供经验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株 收集2018年1月至2019年12月浙江省人民医院和杭州市余杭区第二人民医院门诊及住院患者中分离的血流感染大肠埃希菌241株（已排除同一患者重复分离株），其中浙江省人民医院227株，杭州市余杭区第二人民医院14株。

1.2 药敏试验 使用法国生物梅里埃公司Vitek-MS质谱系统鉴定菌株；药敏试验采用法国生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact系统及革兰阴性细菌GN13药敏卡（批号：1101551403），根据美国抗微生物药物敏感性试验标准（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI2018）的标准判断结果[6]。对于多黏菌素药敏应用微量肉汤稀释法，根据欧洲药敏试验委员会（EUCAST）在2018年修订的标准判断结果（S≤2 mg/L，敏感；R＞2 mg/L，耐药）[7]。应用WHONET 5.6软件统计药敏结果。大肠埃希菌ATCC25922为药物敏感性质控菌株。

1.3 多黏菌素耐药相关基因及其他β-内酰胺酶耐药基因检测 采用PCR法。仪器为ABI5700型PCR扩增仪（美国ABI Applied公司），挑取适量菌落通过煮沸法制作细菌DNA模板，相关引物见表1。PCR试剂盒（批号：ABT2231C）、Taq 酶（批号：AIF2212A）、PCR 引物及引物测序均由中国上海生工生物工程有限公司完成。PCR反应参照朱永泽等[8]研究，具体过程及各项参数：95℃预变性10 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃60 s，循环34个周期，最后72℃延伸 7 min。扩增产物应用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶电泳成像仪下观察并纪录结果。DNA测序结果经BLAST程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，与GenBank上公布的耐药基因进行比对。此外其他β-内酰胺酶耐药基因检测按上述方法进行，引物参考Quan等[9]研究。

表1 PCR引物序列

1.4 质粒接合试验 6株携带mcr-1基因的大肠埃希菌为供体菌，叠氮钠耐药的大肠埃希菌J53为受体菌。两种菌分别应用MH肉汤增菌培养，37℃、180 r/min振荡培养6 h，将受体菌与供体菌按1:1混合，取20 μl混合液滴加于0.22 μm孔径无菌滤膜，并将滤膜贴于MH培养基上，37℃培养18～24 h。次日，用MH肉汤冲洗滤膜并取20 μl混合液滴加于含300 mg/L叠氮钠与4 mg/L多黏菌素的MH平板，同时单独吸取供体菌及受体菌各20 μl接种于同一平板作为对照培养。接合子鉴定通过药物敏感试验初步判断，进一步应用PCR法检测mcr-1基因验证耐药基因是否成功转移。

1.5 菌株多克隆序列位点（multilocus sequence typing，MLST）测定及进化树构建 按照上述PCR程序扩增大肠埃希菌 7 个管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA），进一步对其PCR产物进行测序，将序列在MLST 数据库（http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）进行比对。系统进化树应用大肠埃希菌gyrB基因进行系统发育分析，采用MEGA 5软件进行分析。

2 结果

2.1 241株血流感染大肠埃希菌药敏结果分析 本研究显示血液标本中共分离6株多黏菌素耐药大肠埃希菌，分离率为2.5%。药敏结果显示，大肠埃希菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、复方新诺明、环丙沙星及左旋氧氟沙星耐药率分别为69.7%、58.5%、58.1%、49.4%、43.6%、41.9%；大肠埃希菌对哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、亚胺培南与美罗培南的耐药率均为1.7%，对多黏菌素耐药率仅为2.5%，未分离到对替加环素耐药的菌株。具体药敏结果见表2。

表2 241株血流感染大肠埃希菌药敏结果分析[株（%）]

2.2 多黏菌素耐药大肠埃希菌耐药基因检测结果PCR检测显示6株多黏菌素耐药大肠埃希菌均携带mcr-1耐药基因，未发现其他mcr亚型基因。

2.3 多黏菌素耐药大肠埃希菌临床特点 多黏菌素耐药大肠埃希菌导致血流感染患者中男2例，女4例；年龄主要分布于51～60岁，占66.7%（4/6）。所有患者都曾接受过广谱抗生素治疗，近期均没有出国旅行史。

2.4 携带mcr-1耐药基因菌株多克隆序列位点及其他β-内酰胺酶耐药基因检测 应用大肠埃希菌7对管家基因对6株携带mcr-1基因大肠埃希菌进行克隆分型，测序分析结果显示这些菌株均为不同型别，提示克隆以散发为主，未形成优势克隆，见表3和图1。此外，除了携带mcr-1基因外，这6株菌株同时还携带其他β-内酰胺酶基因，包括 blaTEM-1A、blaTEM-1B、blaOXA-1、blaCTX-M-123、blaCTX-M-14及 blaNDM-5等，具体见表3。

表3 6株携带mcr-1基因大肠埃希菌多克隆位点型别及其他β-内酰胺酶基因检测结果

图1 6株携带多黏菌素耐药基因mcr-1的大肠埃希菌根据gyrB基因构建进化树图（E1～6表示6株菌株）

2.5 质粒接合试验 6株多黏菌素耐药大肠埃希菌mcr-1耐药基因均可以成功传递至受体菌大肠埃希菌J53菌株中，说明该耐药基因定位于质粒，并可以进行水平传播。

3 讨论

本研究显示血液标本中共分离6株多黏菌素耐药大肠埃希菌，分离率为2.5%，经PCR检测显示6株均携带mcr-1基因。本研究分离率与之前我国血流感染大肠埃希菌携带mcr-1基因研究（1.2%）相比有所上升[9]。值得注意的是，6株菌株均从住院患者中分离，并且都曾接受过广谱抗生素治疗。药敏试验结果显示，产mcr-1分离株对碳青霉烯类耐药率为16.7%，对第三代头孢菌素耐药率为66.7%，对氟喹诺酮类耐药率为33.7%。对氨基糖苷类耐药率为33.3%，所有分离株均对替加环素敏感。多黏菌素是治疗耐药肠杆菌科细菌的选择用药之一，国内专家共识已明确说明由于肠杆菌科细菌对多黏菌素也存在耐药，故临床不能单一用药，应联合用药[10]。

除了mcr-1基因外，这6株菌株还携带其他β-内酰胺酶耐药基因，特别是菌株E6还携带blaNDM-5基因。多黏菌素是治疗产金属酶菌株的最后用药之一，然而出现了同时携带金属酶耐药基因及多黏菌素耐药基因mcr-1的大肠埃希菌，提示菌株耐药基因有进一步整合趋势，从而加速全耐药表型菌株出现。已有研究表明，blaNDM基因能够与替加环素或多黏菌素耐药表型共存于同一菌株中[11]，这无疑会导致所谓的“超级细菌”分离株，并加速进入“抗生素后时代”[12]，临床需予以重视。

早期研究认为携带mcr-1基因的大肠埃希菌以散发克隆为主[9]，本研究进一步支持这一观点。MLST研究显示6株携带多黏菌素耐药的大肠埃希菌均为不同克隆型别，基因进化树进一步明确菌株之间无遗传关联，但近年来mcr-1基因在肠杆菌科中的广泛传播仍需引起临床关注[13]。此外，接合实验表明mcr-1基因都定位于可结合质粒上，可导致该基因进一步水平播散。质粒介导多黏菌素耐药基因mcr-1在大肠埃希菌中出现，应引起临床高度重视，加强耐药监测，严格控制医院感染，避免多黏菌素耐药大肠埃希菌暴发流行。