ZNF667-AS1在结直肠癌组织中的表达及其对细胞增殖的影响

吴莉萍 高学仁 王建国

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种严重威胁人类健康的消化系统恶性肿瘤，其全球发病率居高不下且存在明显的地域差异[1-2]。我国属于CRC低发国家，但是近年来随着社会经济的发展、人口老龄化以及生活方式的改变，CRC发病率呈明显上升趋势[3]。目前虽然学者们对CRC的诊断、治疗及发病机制等做了大量研究工作，但由于CRC具有发现晚、侵袭性强、致病机制复杂等特性[4]，亟需探讨其诊断标志物及分子致病机制，从而为早发现、早诊断、早治疗提供新的思路。ZNF667-AS1属于锌指蛋白667反义链RNA，作为一种长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）参与多种细胞的生物学过程，进而影响疾病的发生、发展[5]。ZNF667-AS1最早在乳腺上皮细胞中被发现，其在多种恶性肿瘤中呈低表达[6]。目前关于ZNF667-AS1的研究报道较少，在CRC中的生物学功能也尚不清楚，故本研究检测了ZNF667-AS1在CRC组织和细胞系中的表达，并结合细胞生物学实验探讨ZNF667-AS1在CRC发生、发展中的作用机制，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 标本cDNA来源 CRC组织及癌旁（距离癌组织5 cm处）正常组织标本来自2017年3月至2019年3月在上海交通大学医学院附属新华医院接受CRC切除手术治疗的24例CRC患者，组织标本cDNA由高学仁教授惠赠。所有患者术前均未接受过放化疗，术后均经病理学诊断证实。本研究经嘉兴市妇幼保健院医学伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 细胞系 人CRC细胞系（HCT116、SW480、Lovo）、结直肠上皮细胞系（NCM460）均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.3 主要试剂 pCDNA3.1-ZNF667-AS1过表达载体由上海生物工程股份有限公司构建；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；FBS、DMEM培养基、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；马血清购自上海生物工程有限公司；Trizol购自生工生物工程（上海）股份有限公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Thermo公司；逆转录试剂盒5X Prime ScriptRTMaster Mix购自美国TaKaRa公司；RT-PCR试剂qPCR SYBR Master Mix购自美国YEASEN公司；所有引物在上海生工科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 ZNF667-AS1过表达载体构建 利用PCR法从人类基因组中扩增ZNF667-AS1序列，双酶切将目的基因通过T4链接酶构建到pCDNA3.1-N1空载体上。采用双酶切法及Sanger测序方法鉴定pCDNA3.1-ZNF667-AS1载体构建成功。

1.4.2 细胞培养 用含10%FBS的DMEM培养基培养SW480、HCT116细胞，含10%FBS的RPMI1640培养基培养Lovo细胞，含10%马血清的DMEM/F12培养基培养NCM460细胞，各添加0.1 U/L青霉素、0.1 U/L链霉素，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，胰酶消化传代。

1.4.3 细胞系构建 当细胞生长状态良好且细胞密度达到80%～90%时，用胰酶消化细胞，按5×105个/孔接种至6孔板中；待细胞生长到80%融合时，分别将过表达质粒（pCDNA3.1-ZNF667-AS1）和空载体（pCDNA3.1-N1）4 μg 稀释在 250 μl无血清 RPMI1640 培养基中，6 μl Lipofectamine 2000稀释在 250 μl无血清 RPMI1640中，分别单独孵育5 min后混合，37℃孵育20 min转入细胞中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养6 h，更换新鲜的含10%FBS的RPMI1640完全培养基。转染过表达质粒（pCDNA3.1-ZNF667-AS1）细胞为过表达组，转染空载体（pCDNA3.1-N1）为空载组，未转染质粒的细胞为对照组。

1.4.4 ZNF667-AS1 mRNA相对表达量检测 采用RT-qPCR法。取100 mg组织标本或1×105个培养细胞，采用Trizol法提取组织标本或细胞中总RNA，参照Prime－ScriptRTMaster Mix反转录试剂盒说明书进行反转录反应，在10 μl体系中加入500 ng总RNA进行cDNA合成。PCR选用2×qPCR SYBR Master Mix，以适量cDNA作为模板，引物浓度0.4 μmol/L；每个待测样本设置4个平行样，根据目标基因设计合成相应上下游引物进行PCR 扩增；以β-actin作为内参，采用 2-ΔΔCt法计算 ZNF667-AS1 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.5 ZNF667-AS1过表达对SW480细胞增殖的影响 采用CCK-8法。将过表达组、空载组及对照组细胞胰酶消化后，重悬于完全培养基中，调整浓度至20 个/μl；按 100 μl/孔加入 96 孔板中，每组设 5 个复孔。每孔加入10 μl CCK-8，置于培养箱中孵育2 h，连续测量 0、24、48、72、96 h 时在 450 nm 波长处的吸光度值（OD450）。

1.4.6 ZNF667-AS1过表达对SW480细胞克隆形成的影响 采用平板克隆实验。将过表达组、空载组及对照组细胞胰酶消化后重悬，以1 000个/孔接种于6孔板中，每5 d换1次培养液，第11～14天在显微镜下可见单个细胞团细胞数＞100个时吸去培养液，甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min后干燥，拍照并计数。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，两组比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC组织与癌旁正常组织中ZNF667-AS1 mRNA相对表达量比较 与癌旁正常组织比较，CRC组织中ZNF667-AS1 mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05），见图1。

图1 结直肠癌（CRC）组织与癌旁正常组织中ZNF667-AS1 mRNA相对表达量比较（*P＜0.05）

2.2 人CRC细胞系与结直肠上皮细胞系中ZNF667-AS1 mRNA相对表达量比较 与结直肠上皮细胞系NCM460 比较，人 CRC 细胞系（HCT116、SW480、Lovo）ZNF667-AS1 mRNA相对表达量均明显降低（均P＜0.05），见图 2。

图2 结直肠癌（CRC）细胞系与结直肠上皮细胞系中ZNF667-AS1 mRNA相对表达量比较（*P＜0.05）

2.3 CRC细胞系ZNF667-AS1过表达验证 在HCT116、SW480细胞中，过表达组ZNF667-AS1 mRNA相对表达量明显高于空载组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。提示构建ZNF667-AS1过表达模型成功，本研究选取SW480细胞的ZNF667-AS1过表达模型用于后续增殖实验。

图3 结直肠癌（CRC）细胞系中ZNF667-AS1过表达验证（a：SW480；b：HCT116；与空载组比较，*P＜0.05）

2.4 ZNF667-AS1过表达对SW480细胞增殖的影响 ZNF667-AS1过表达组与对照组OD450值在第24 h时比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；在第 48、72、96 h时ZNF667-AS1过表达组OD450值明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且随时间的推移，差异逐渐增大，见图4。

图4 ZNF667-AS1过表达对SW480细胞增殖的影响（OD为吸光度值；*P＜0.05）

2.5 ZNF667-AS1过表达对SW480细胞克隆形成的影响 ZNF667-AS1过表达组所形成的克隆数为（122±11）个，明显少于对照组的（361±13）个，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 5。

图5 ZNF667-AS1过表达对SW480细胞克隆形成的影响（×10）

3 讨论

lncRNA是一类长度＞200个核苷酸的非编码RNA，参与细胞转录及转录后调控等过程，在细胞增殖、凋亡、侵袭中发挥重要作用；同时能通过与多种微小RNA等相互作用，参与肿瘤的发生、发展[7-10]。ZNF667-AS1作为一种lncRNA，长度为1837bp，位于19号染色体19q13.43。相关研究最早报道ZNF667-AS1在心肌缺血组织中高表达[11-12]，进而保护细胞免受缺氧损伤[13]。相关数据库显示，ZNF667-AS1基因在乳腺癌、结肠腺瘤、子宫颈癌等十几种肿瘤中呈低表达，主要出现在癌变早期[13-14]。近期亦有研究发现ZNF667-AS1通过抑制JAKU-STAT通路来抑制炎症反应，进而促进脊髓损伤恢复[15]。在肿瘤中，ZNF667-AS1可通过激活ANK2/JAK2表达来抑制CRC细胞侵袭[16]。本文就ZNF667-AS1在结直肠癌组织中的表达及其对细胞增殖的影响作一探讨。

本研究发现，ZNF667-AS1在CRC组织中的mRNA相对表达量较癌旁正常组织明显降低，提示ZNF667-AS1 mRNA低表达与CRC的发生、发展密切相关。Zhao等[13]研究表明，ZNF667-AS1 mRNA低表达是CRC的独立预后因子，与本研究结果一致。本研究通过检测不同CRC细胞系ZNF667-AS1 mRNA表达发现，与结直肠上皮细胞比较，ZNF667-AS1在CRC细胞中的mRNA相对表达量均明显降低；进一步研究发现，ZNF667-AS1 mRNA相对表达量与CRC细胞增殖及克隆形成有关，在SW480细胞系中过表达ZNF667-AS1，CRC细胞增殖能力明显下降，克隆形成明显减少。

综上所述，ZNF667-AS1在CRC组织中呈低表达，过表达ZNF667-AS1可抑制CRC细胞增殖及克隆形成能力，提示ZNF667-AS1作为一个抑癌因子，参与CRC细胞的生长、增殖进程，可能作为潜在的生物靶点发挥生物学功能。