5-氮杂-2-脱氧胞苷对MEG3启动子超甲基化逆转及膀胱癌细胞凋亡的作用

姜应传 陈炳 邬嘉波 王婕 张小荣

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有54.9万例新发病例，约20万例患者死于膀胱癌，且发病率和病死率仍在不断上升[1]。近年来研究发现，一些长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）作为基因表达的重要调控因子，参与调节膀胱癌细胞增殖、分化和凋亡等过程[2]。母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是最早被发现具有抑癌作用的lncRNA之一，在多数肿瘤中呈低表达或表达缺失，而启动子超甲基化可能是导致其低表达的原因之一[3]。本研究使用不同浓度的DNA甲基化特异性抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-Aza-CdR）作用人膀胱癌T24细胞，检测MEG3启动子甲基化程度、MEG3 mRNA表达和细胞凋亡情况，进而探讨5-Aza-CdR对MEG3启动子超甲基化逆转及膀胱癌细胞凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 人膀胱癌细胞系T24购自上海生工细胞库。FBS（批号：11011-8611）购自杭州四季青生物公司，胰蛋白酶（批号：25200114）、DMEM 培养基（批号：11995065）均购自美国 Gibco公司；5-Aza-CdR（批号：A3656）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；批号：D2650）均购自美国Sigma公司；QIAmp DNA Mini Kit试剂盒（批号：51304）、EpiTect Bisulfite Kit（批号：59104）、EpiTect MSP Kit试剂盒（批号：59496）均购自德国Qiagen公司；荧光定量试剂盒（批号：A6001）、反转录试剂盒（批号：A5001）均购自美国 Promega公司；Hoechst33258试剂盒（批号：C1011）购自上海碧云天生物技术研究所；Annexin V PE/7-AAD凋亡试剂盒（批号：559763）购自美国BD生物科学公司，各引物购自上海生工生物工程公司。

1.2 药物配置 5 mg 5-Aza-CdR溶于DMSO中，配制成浓度为2.2×105μmol/L的母液，置于-20°C冰箱内储存；用 DMEM 培养基配制浓度为 0、2.5、10 μmol/L 的5-Aza-CdR培养液，同时用DMEM培养基配制浓度为0、2.5、10 μmol/L 的 DMSO 培养液，于 4 °C 保存。

1.3 细胞培养 人膀胱癌T24细胞用10%FBS+DMEM培养基，于37℃、含5%CO2的培养箱中培养。每1～2 d换液1次，当细胞生长至90%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1.4 MEG3启动子甲基化程度检测 采用甲基化特异性PCR法。T24细胞按1.0×105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，实验组加入浓度为 0、2.5、10 μmol/L的5-Aza-CdR培养液，对照组加入浓度为0、2.5、10 μmol/L的DMSO培养液，分别作用3 d。收集细胞，按照 QIAmp DNA Mini Kit、EpiTect Bisulfite Kit试剂盒说明书进行基因组DNA提取和亚硫酸盐修饰。MEG3基因甲基化特异性引物序列如下，甲基化引物：正向5'-GTT AGTAATCGGGTTTGTCGGC-3'，反向 5'-AATCATAACTCCGAACACCCGCG-3'；非甲基化引物：正向5'-GAGGATGGTTAGTTATTGGGG T-3'，反向 5'-CCA CCATAACCAACACCCTATAATCACA-3'。按EpiTectMSP Kit试剂盒说明书在PCR扩增仪（MyCycler，美国Bio-Rad公司）上进行甲基化特异性PCR。扩增反应总体系50 μl，其中EpiTect Master Mix 25 μl（1×）、primer A 2 μl（0.4 μmol/L）、primer B 2 μl（0.4 μmol/L）、模板DNA（＜200 ng/50 μl）、RNase free dH2O 补足至 50 μl。扩增条件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳后观察，使用凝胶成像仪（Universal HoodⅡ，美国Bio-Rad公司）摄像。出现甲基化条带而未出现非甲基化条带提示超甲基化，而非甲基化条带越清晰代表甲基化程度越低。

1.5 MEG3 mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。T24细胞按1.0×105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，加入浓度为 0、2.5、10 μmol/L 的 5-Aza-CdR 培养液作用3 d。使用Trizol试剂提取总RNA，将提取的RNA进行反转录和PCR扩增。MEG3引物序列：正向5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3'，反向 5'-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3'。每个待测样品设置3个平行复孔，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参。PCR体系：10 μl 2×SYBR Premix Ex Taq；1 μl Reverse Primer；5.2 μl RNase Free dH2O；4 μl cDNA；0.2 μl DyeⅡ；1 μl Forward Primer。在RT-qPCR仪（7500 fast Real-Time PCR system，美国ABI公司）上进行反应。反应程序：95℃2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，60℃ 60 s，40个循环。记录 Ct值，采用2－ΔΔCt方法计算MEG3 mRNA相对表达量。

1.6 细胞凋亡检测 （1）采用Hoechst33528核染色法。在6孔板中配置2 ml密度为2×104个/ml的T24细胞悬液，加入 0、2.5、10 μmol/L 的 5-Aza-CdR 培养液作用3 d。用0.1%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min；加入Hoechst33258 染色液（1：1 000）避光作用 10 min；置于荧光显微镜（LSM800，德国Zeiss公司）下，在波长340 nm处进行观察。在荧光显微镜下，存活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞在细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。（2）采用流式细胞术。T24细胞按1.0×105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，加入浓度为0、2.5、10 μmol/L的5-Aza-CdR作用3 d。将细胞浓度调整为1×106个/ml，用预冷的PBS洗涤细胞1次，再用冷的盐酸缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min；弃上清液，收集细胞，加入500 μl结合缓冲液重悬细胞；再次离心沉淀细胞，小心吸除上清液；用去离子水按 1:3稀释结合缓冲液（4 ml 4×结合缓冲液+12 ml去离子水）；用1×结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为1×106个/ml；取100 μl细胞悬液于5 ml流式管中，加入 5 μl Annexin V PE混匀后于室温避光孵育5 min；加入10 μl 20 mg/L的 7-AAD、400 μl PBS，立刻使用流式细胞仪（FACSVia，美国BD公司）进行检测。凋亡率=早期凋亡率（右下象限）+晚期凋亡率（右上象限）；实验重复3次，取平均值。

1.7 统计学处理 采用Graphpad Prism 7.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同药物作用后T24细胞MEG3启动子甲基化程度比较 对照组出现清晰的M带（甲基化条带）未出现U带（非甲基化条带），提示对照组MEG3启动子发生超甲基化；实验组随5-Aza-CdR浓度的增加逐渐出现清晰的U带，MEG3启动子甲基化程度随着5-Aza-CdR浓度增加而下降，见图1。

图1 不同药物作用后T24细胞母系表达基因3（MEG3）启动子甲基化程度比较

2.2 不同浓度5-Aza-CdR作用后T24细胞MEG3 mRNA表达比较 0、2.5、10 μmol/L 5-Aza-CdR作用T24细胞后MEG3 mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、3.17±0.14、6.73±0.57，差异有统计学意义（F=73.43，P＜0.05），且MEG3 mRNA相对表达量随着5-Aza-CdR浓度增加而增加（均P＜0.05）。

2.3 不同浓度5-Aza-CdR作用后T24细胞凋亡情况比较 在荧光显微镜下，0 μmol/L组T24细胞形态基本正常，2.5 μmol/L 组、10 μmol/L 组 T24细胞出现不同程度的凋亡，表现为荧光集中，核固缩、分解等形态，见图2（插页）。流式细胞术检测显示，0、2.5、10 μmol/L 5-Aza-CdR作用T24细胞后细胞凋亡率分别为（0.34±0.05）%、（11.49±0.36）%、（17.53±2.03）%，差异有统计学意义（F=53.28，P＜0.05），且 T24细胞凋亡率随着 5-Aza-CdR浓度增加而升高（均P＜0.05），见图3（插页）。

图2 不同浓度5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）作用后T24细胞凋亡情况（Hoechst33528核染色，×200）

图3 不同浓度5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）作用后T24细胞凋亡情况（流式细胞术）

3 讨论

膀胱癌的演化和进展与多种癌基因及抑癌基因异常表达有关[4]。DNA甲基化是表观遗传学重要的调控过程之一，可以直接改变其表观遗传学内容或使基因发生突变，导致抑癌基因“静默”，从而导致肿瘤恶性转化[5]。目前已在多种恶性肿瘤中发现MEG3启动子存在异常甲基化的CpG岛（胞嘧啶C和鸟嘌呤G富集的区域），而且这种改变可能与MEG3表达降低有关[3，6]。另有研究发现，MEG3在多种肿瘤中通过调控不同信号通路发挥抑癌作用，比如在非小细胞肺癌、胰腺癌中，MEG3可以通过激活p53引发肿瘤细胞凋亡[7]。而5-Aza-CdR是已知最强的DNA甲基化特异性抑制剂，能抑制DNA甲基化。研究表明，去甲基化可诱导MEG3重新活化和表达[8]。故本研究使用不同浓度5-Aza-CdR作用人膀胱癌T24细胞，以探讨其对MEG3启动子超甲基化逆转及膀胱癌细胞凋亡的作用。

本研究检测MEG3启动子甲基化程度发现，对照组、0 μmol/L 5-Aza-CdR组T24细胞均呈现超甲基化状态，同时MEG3启动子甲基化程度随着5-Aza-CdR浓度增加而下降。这说明在膀胱癌细胞中存在MEG3启动子甲基化，而5-Aza-CdR能够逆转膀胱癌细胞中MEG3启动子甲基化，其原理可能是5-Aza-CdR通过共价结合DNA甲基化转移酶的方式来抑制DNA甲基化转移酶的活性，从而抑制MEG3启动子甲基化效应，使其呈去甲基化状态。本研究继续采用RT-qPCR检测MEG3 mRNA表达，发现5-Aza-CdR作用后T24细胞恢复MEG3 mRNA表达，且相对表达量随着5-Aza-CdR浓度增加而增加。这间接表明MEG3基因表达下调归因于其启动子超甲基化。相关研究表明，MEG3表达与肿瘤的发生呈负相关，MEG3在许多恶性肿瘤中发挥着抑癌作用[9]。为了明确MEG3恢复表达后对膀胱癌细胞产生何种效果，本研究进一步采用Hoechst33528核染色法和流式细胞术检测T24细胞凋亡情况，结果发现5-Aza-CdR作用后T24细胞出现不同程度的凋亡，且随着5-Aza-CdR浓度增加而凋亡程度更明显。

综上所述，5-Aza-CdR可能通过逆转膀胱癌细胞中MEG3启动子超甲基化状态来恢复MEG3 mRNA表达，进而诱发膀胱癌细胞发生凋亡，但具体分子机制有待进一步研究证实。