七氟醚预处理对大鼠肺缺血-再灌注损伤的保护作用及对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

范军朝 宋俊杰 陈勇

肺移植手术过程中，由肺部供血不足、恢复灌注时引起的急性肺损伤是临床上常见的问题，也是导致肺移植术后受者病死率高的主要因素之一[1]。肺缺血 -再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是一个复杂的病理生理过程，可能与氧化应激、炎症反应导致的中性粒细胞浸润，内皮细胞损伤、凋亡坏死等密切相关[2-3]。研究表明，手术中使用的麻醉药物，尤其是一些吸入型麻醉药对IRI有保护作用[4]。七氟醚作为全身麻醉中常用的吸入型麻醉药，具有麻醉诱导迅速、对病人呼吸道刺激小、苏醒快速完全等优势，同时对多种IRI的器官均具有一定的保护作用[5-7]。研究表明七氟醚对肺IRI也具有一定的保护作用[8]，但具体的分子机制尚不完全清楚。本研究应用大鼠肺IRI模型，探讨七氟醚预处理对肺IRI的保护作用及其分子机制，旨在为七氟醚在肺移植中的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

40只健康雄性成年SD大鼠，6～8周龄，体质量220～320 g，由郑州大学医学院动物实验中心提供。将SD大鼠随机分成对照组（Sham组）、模型组（LIRI组）、七氟醚预处理组（Sev组）和Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）抑制剂 TAK-242 联合七氟醚预处理组（TAK+Sev组），每组各10只。Sham组大鼠进行假手术处理。LIRI组大鼠建立肺IRI模型。Sev组大鼠建立肺IRI模型前1 h进行七氟醚干预。TAK+Sev组大鼠尾静脉注射TAK-242（10 mg/kg），1 min后进行七氟醚干预，1 h后建立肺IRI模型。本研究经河南大学第一附属医院伦理委员会审批通过。

1.2 主要试剂和仪器

七氟醚购自武汉艾美捷科技有限公司；10%水合氯醛购自上海国药集团化学试剂有限公司；TAK-242、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick- end labeling，TUNEL）染色试剂盒和酶联免疫吸 附 试 验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；TLR4 抗体、髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88） 抗 体、 核 因 子（nuclear factor，NF）-κB 抑 制 蛋 白 α（NF-κB inhibitor protein α，IκBα）抗体、NF-κB p65 抗体、β-actin 抗体及二抗均购自英国Abcam公司；全自动生化分析仪购自美国Berkam公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 动物建模及标本取材

假手术处理：打开胸腔后，动脉夹仅穿过左肺门，不进行阻断。建立肺IRI模型：术前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛5 mL/kg进行麻醉，气管插管后接小动物呼吸机，呼吸频率70 次/分，吸入氧浓度21%，吸呼比为1:2，潮气量 10～12 mL/kg。将麻醉后的大鼠固定在手术台上，剪开颈部皮肤，经右颈静脉注入肝素钠500 U/kg，于左侧胸骨第5肋间开胸，用无损伤血管钳夹阻断左肺门，造成左肺缺血。观察左肺组织，通气时不再膨胀，颜色变深，表明阻断成功。阻断左肺门1 h后松开动脉夹，再灌注2 h。当松开动脉夹，肺组织迅速膨胀，颜色变回缺血前表示再灌注成功。七氟醚干预：将大鼠置于自制密闭的实验舱里，调节七氟醚浓度为2.1%，氧气浓度为21%，预处理30 min后恢复正常通气 30 min。

建立肺IRI模型24 h后，经大鼠尾静脉取血，静置 1～2 h 后，1 200×g 离心 10 min，分离血清，置于-80℃冻存，用于后续检测。而后腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg对大鼠进行麻醉，处死大鼠后取出左肺组织。部分新鲜的肺组织进行湿重/干重（wet-to-dry，W/D）比值测定；部分置于4%多聚甲醛溶液中固定；其余部分肺组织置于液氮中冻存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 病理学检查 取 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 的肺组织制作石蜡切片，进行苏木素-伊红（hematoxylineosin，HE）染色。将切片烘干后，经二甲苯脱蜡，乙醇梯度洗涤后，苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化后，伊红染色1 min，自来水冲洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。采用光学显微镜观察肺组织病理学变化并进行病理损伤评分[9]。

1.4.2 TUNEL 法检测肺组织细胞凋亡 采用 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测肺组织细胞凋亡，计算细胞凋亡率。将肺组织石蜡切片进行脱蜡复水，蛋白酶K消化，加入TUNEL反应缓冲液后避光孵育，4＇, 6-二脒基 -2-苯 基 吲 哚（4＇, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染细胞核，抗荧光猝灭剂封片。荧光显微镜下观察各组细胞凋亡情况，阳性细胞呈红色荧光。每组选取5张片子，每张片子随机选取5个视野（×200），细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.4.3 肺组织湿重/干重比值检测 将新鲜的肺组织用生理盐水清洗，滤纸吸干表面多余水分后称重即肺湿重（W），放入65 ℃恒温干燥箱中干燥48 h，至重量不再减少后称重即肺干重（D），计算W/D比值。

1.4.4 肺组织中氧化应激相关指标的检测 取冻存的部分肺组织，加入9倍的生理盐水匀浆处理，离心后取上清液进行检测。采用硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平，WST-8法测定总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的水平。

1.4.5 肺组织和血清中炎症因子的检测 采用ELISA检测肺组织中单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-2 和血清中白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、可溶性细胞间黏附分子（soluble intercellular adhesion molecule，sICAM）-1的水平。采用联茴香胺比色法测定肺组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的水平。

1.4.6 蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达 取部分冻存的肺组织，液氮研磨后，加入RIPA 蛋白裂解液充分裂解，提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品通过聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜后采用5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，加入一抗[TLR4抗体（1:1 000）、MyD88 抗体（1:1 000）、IκBα 抗体（1:1 000）、NF-κB p65 抗体（1:500），β-actin抗体（1:2 000）]4 ℃孵育过夜，二抗（1:1 000）室温孵育1 h，滴加ECL底物发光显色。采用凝胶图像分析系统检测条带灰度，计算目的蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 七氟醚对肺组织病理损伤的影响

各组大鼠的肺组织切片HE染色结果见图1。Sham组肺泡结构清晰，间质和肺泡腔内未见明显液体渗出和炎症细胞浸润。LIRI组大鼠肺组织结构严重受损，肺泡壁断裂，结构紊乱、变形，间质水肿，肺泡内有大量液体渗出和炎症细胞浸润，可见较多红细胞。Sev组和TAK+Sev组肺泡结构相对完整，间质轻度水肿，肺泡内的液体渗出、炎症细胞浸润及红细胞明显减少，病理损伤减轻。LIRI组和Sev组大鼠肺组织的病理损伤评分分别为（5.41±0.74）分和（3.37±0.57）分，较Sham组[（0.42±0.18）分]均升高（均为P＜0.05）。Sev组大鼠肺组织病理损伤评分较LIRI组降低，而TAK+Sev组大鼠肺组织病理损伤评分[（2.45±0.39）分]较Sev组和LIRI组均降低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。

图1 各组大鼠肺组织的病理学表现（HE，×200）Figure 1 Pathological findings in lung tissues of rats among each group

2.2 七氟醚对肺组织湿干重比及细胞凋亡的影响

各组大鼠肺组织TUNEL染色结果见图2 A、B。与Sham组比较，LIRI组和Sev组大鼠肺组织的细胞凋亡率、W/D比值均升高（图2B、C，均为P＜0.05）。Sev组和TAK+Sev组大鼠肺组织的细胞凋亡率、W/D比值较LIRI组均降低，TAK+Sev组大鼠肺组织的细胞凋亡率、W/D比值较Sev组降低，差异均有统计学意义（图2 B、C，均为P＜0.05）。

图2 各组大鼠肺组织W/D比值和细胞凋亡率的比较Figure 2 Comparison of W/D ratio and cell apoptosis rate in lung tissues of rats among each group

2.3 七氟醚对肺组织氧化应激相关指标的影响

各组大鼠肺组织MDA和SOD水平比较见图3。与Sham组比较，LIRI组和Sev组大鼠肺组织中MDA水平均升高，SOD水平均降低（均为P＜0.05）。Sev组和TAK+Sev组的MDA水平较LIRI组均降低，而SOD水平较LIRI组均升高（均为P＜0.05）。与Sev组比较，TAK+Sev组大鼠肺组织的MDA水平降低（P＜0.05），而SOD水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组大鼠肺组织MDA和SOD水平的比较Figure 3 Comparison of levels of MDA and SOD in lung tissues of rats among each group

2.4 七氟醚对肺组织和血清中炎症因子水平的影响

各组大鼠肺组织及血清中炎症因子水平比较见图4。与Sham组比较，LIRI组和Sev组IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-2、sICAM-1和 MPO 水 平均升高（均为P＜0.05），Sev组和TAK+Sev组上述炎症因子水平较LIRI组均降低（均为P＜0.05），TAK+Sev组上述炎症因子水平较Sev组均降低（均为 P＜0.05）。

图4 各组大鼠肺组织和血清炎症因子水平的比较Figure 4 Comparison of levels of inflammatory factors in lung tissues and serum of rats among each group

2.5 七氟醚对肺组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

各组大鼠肺组织中相关蛋白表达情况见图5。与Sham组比较，LIRI组和Sev组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白相对表达量均升高，IκBα相对表达量降低（均为P＜0.05）。Sev组和TAK+Sev组大鼠肺组织中 TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白相对表达量较LIRI组均降低，IκBα相对表达量较LIRI组升高（均为P＜0.05）。与Sev组比较，TAK+Sev组中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量均降低，IκBα相对表达量升高（均为P＜0.05）。

图5 各组大鼠肺组织TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关蛋白表达的比较Figure 5 Comparison of related proteins of TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway in lung tissues of rats among each group

3 讨 论

本研究探讨七氟醚预处理对SD大鼠肺IRI的保护作用及可能的机制，结果发现七氟醚预处理能够减轻肺IRI，而TLR4抑制剂联合七氟醚预处理能够进一步减轻肺IRI过程中的组织损伤，与吕帅国等[10]和Li等[11]的研究结果较为一致。当机体发生IRI时，损伤部位可产生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），从而引发体内脂质过氧化，产生MDA，破坏细胞膜和线粒体膜结构，使机体内的一些酶和蛋白质发生变性而失活，造成机体功能破坏，诱导细胞凋亡[12-14]。而研究表明，七氟醚可以抑制ROS的产生，从而对发生IRI的器官具有一定的保护作用[15-16]。本研究结果也显示，IRI时肺组织中MDA水平明显升高，SOD水平明显降低，而七氟醚预处理能够降低MDA水平和升高SOD水平，减轻大鼠肺组织的氧化应激。

炎症反应是发生IRI的关键因素。发生肺IRI时往往伴随着大量中性粒细胞的聚集，而炎症反应产生的炎症因子、趋化因子和黏附分子能进一步激活中性粒细胞，并趋化使其发生浸润聚集[17]。MPO作为中性粒细胞中的特异性酶，其活性的高低可以间接反映中性粒细胞的聚集程度和炎症反应程度。而内皮细胞产生的细胞间黏附分子和血管细胞黏附分子能够促进其与炎症细胞发生黏附，导致内皮细胞损伤[18]。炎症因子如TNF-α能够激活免疫细胞，促进IL-6等的分泌，启动级联放大反应，促进血管内皮细胞和中性粒细胞的黏附，导致血管通透性受阻，加剧炎症反应，进一步加重肺损伤[19-20]。杨国庆等[21]研究发现，七氟醚预处理可以改善心肌组织损伤，降低NF-κB、TNF-α、IL-6水平。本研究结果显示七氟醚预处理能够减轻肺IRI过程中的炎症反应，抑制氧化应激，减轻肺组织损伤，而七氟醚联合TLR4抑制剂处理能够进一步减轻肺IRI过程的炎症反应。

肺IRI过程的炎症反应调节机制较为复杂，而TLR4作为炎症开关，可通过调节MyD88介导的NF-κB信号通路激活机体免疫炎症反应。NF-κB作为TLR4中重要的信号传导因子，正常生理条件下以无活性的NF-κB p65、p50/52等形成的四聚体与抑制性蛋白IκBα结合，但在IRI的作用下，IκBα被降解，NF-κB p65分离后单独转移到细胞核中，诱导机体释放大量炎症因子，引发瀑布式炎症反应[22-24]。有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的炎症反应在心肌、脑等器官IRI中发挥重要的作用[25-27]。吕帅国等[10]研究提示七氟醚能够通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路，减轻大鼠肺IRI。本研究结果同样发现，TLR4抑制剂联合七氟醚预处理可下调 TLR4、MyD88和 NF-κB p65蛋白表达，而上调IκBα表达，提示七氟醚预处理能够抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活，进而减轻肺IRI。

综上所述，七氟醚预处理能够抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活，抑制炎症反应和氧化应激，从而减轻大鼠肺IRI。