IL-10改善心脏死亡大鼠离体肺灌注后供肺功能的实验研究

陈英伦 卫栋 王梓涛 杨修成 刘明昭 戴振航 陈静瑜

对于药物或传统外科手术无法治疗的终末期肺病，肺移植已经成为唯一有效的治疗方式[1-2]。但目前我国符合标准的供肺数量无法满足移植需求，导致部分病人等待肺移植的时间过长而死亡[3]。供者一般来源分为心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）和脑死亡器官捐献（donation after brain death，DBD）。与DBD和标准供者肺移植相比，DCD肺移植的缺血损伤更严重，受者围手术期病死率更高且长期生存率更低[4]，DCD供肺的利用一直是肺移植领域的难点。离体肺灌注（ex vivo lung perfusion，EVLP）是应用于肺移植领域的一种评估供肺功能、延长供肺保存时间和修复供肺损伤的技术[5-6]。EVLP可以即时评估供肺功能，为治疗（包括基因治疗）提供参考[7]，从而改善供肺功能，增加符合肺移植条件供肺的数量，在一定程度上缓解了供肺短缺的现状[8-9]。

细胞因子是免疫系统中最重要的效应分子和信使分子之一，在感染和炎症期间参与免疫反应，抑制或促进炎症反应的发生。因此，控制细胞因子通路是治疗感染和炎症最有效的策略之一[10]。白细胞介素（interleukin，IL）-10家族细胞因子在感染和炎症过程中，可通过抑制过度炎症反应、上调先天性免疫和促进组织修复维持组织稳态。它们在疾病中的重要作用被许多动物模型、遗传学研究和临床检测数据证实。之前的研究表明在猪肺中过表达IL-10可减轻移植后炎症反应[11-12]。本实验通过在EVLP过程中向灌注液加入IL-10，探讨IL-10在心脏死亡大鼠供肺功能维护中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年健康清洁级雄性SD大鼠20只，体质量200～300 g，饲养温度 22～25 ℃，相对湿度 55%～60%，自由饮水摄食。随机分成A、B两组，每组10只，A组为对照组，采用A灌注液，B组为实验组，采用B灌注液。

1.2 灌注液配方

A灌注液：每100 mL灌注液含右旋糖酐0.24 g，葡萄糖 0.4 g，氯化钠 0.378 g，白蛋白 7 g，天冬氨酸钾镁 0.082 5 g，磷酸氢钾 0.053 7 g，碳酸氢钠 0.125 g，谷氨酰胺0.04 g，复方氨基酸0.067 4 g，氯化钙0.05 g，注射用甲泼尼龙琥珀酸钠0.05 g[13]。

B灌注液：在A灌注液基础上每100 mL加入1 μg 大鼠 IL-10。

1.3 大鼠EVLP系统构建

灌注液循环回路注入100 mL自制的灌注液。将含有8% CO2、6% O2和84% N2的低氧混合气通入膜氧合器，利用离心泵提供循环动力，使灌注液通过膜氧合器去氧后进入肺循环，肺动脉插管前连接压力监测仪记录动脉灌注压力。将恒温水箱与灌注罐加热层连通。气管插管使用16号金属灌胃针，肺动脉插管使用14号金属灌胃针（图1）。

图1 大鼠EVLP系统Figure 1 EVLP system for rat

1.4 动物模型制备

1.4.1 DCD模型建立 腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液100 mg/kg，尾静脉注射肝素钠 1 200 U/kg。经口气管内插管，机械通气。前正中开腹，剪断腹主动脉，室温放置 1 h。

1.4.2 供肺获取 前正中切口开胸后，分离主肺动脉干，套线，暂不结扎，剪开左心耳、右心室，经右心室向肺动脉干插入插管，结扎固定，向肺动脉灌注低钾右旋糖酐液（low potassium dextran solution，LPD 液）15 mL。迅速游离肺组织，称量心肺重量备用[14]。

1.4.3 EVLP 程序性复温并予以机械通气及动脉灌注。30 min达目标温度（40 ℃）、通气量（7 mL/kg，35次/分）及灌注量 [10 mL/（kg·min）]后维持温度、通气及灌注 4 h。

1.5 实验方法

1.5.1 供肺组织干重/湿重比值计算 灌注结束后取右肺中叶组织，连续称重3次，取平均值，即为湿重（W）。60 ℃过夜烘干后连续称重3次，取平均值，即为干重（D），计算供肺组织干重/湿重（dry-to- wet，D/W）比值。

1.5.2 供肺功能及代谢状态分析 以复温结束为起始时间，每小时取静脉端灌注液测量肺静脉血氧分压、乳酸水平，同时记录压力传感器峰值读数为肺动脉压。

1.5.3 供肺形态学分析 采用10%多聚甲醛溶液固定右肺上叶，常规行石蜡包埋，切片。苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后光学显微镜下进行观察[15]。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）染色后于显微镜下观察并拍摄，细胞核或细胞质染色呈棕褐色为阳性反应。

1.5.4 供肺炎症标志物水平检测 以复温结束为起始时间，每小时留取静脉端灌注液及少量组织，采 用 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）试剂盒测定灌注液中IL-1α、IL-4、IL-6、 肿 瘤 坏 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α、单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的水平。

1.6 研究内容

比较两组供肺外观及D/W比值；分析两组供肺功能和代谢状态，包括肺静脉血氧分压、肺动脉压及乳酸水平；观察两组供肺形态学表现，包括病理学结果及细胞凋亡情况；比较两组供肺炎症标志物水平，包括MCP-1、IL-6、IL-4、TNF-α、IL-1α及iNOS。

1.7 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，同组不同时间点比较采用配对t检验；两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组供肺外观及供肺组织D/W比值比较

A组供肺可见全肺明显水肿，顺应性差，气道内涌出大量水肿液（图2A）；而B组供肺未见明显水肿，顺应性较好（图2B）。与A组比较，B组供肺组织D/W比值较高，差异有统计学意义（P＜0.05，图2C）。

图2 两组供肺外观及供肺组织D/W比值比较Figure 2 Appearance of donor lung and comparison of D/W ratio of donor lung tissues between two groups

2.2 两组供肺功能及代谢状态比较

两组肺静脉血氧分压均在灌注2 h时达到最高，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05，图3A）。B组肺动脉压升高速度较A组慢，灌注结束时B组肺动脉压较A组降低（P＜0.05，图3B）；灌注结束时，B组灌注液中乳酸水平较A组下降（P＜0.05，图3C）。

图3 两组肺静脉血氧分压、肺动脉压及乳酸水平比较Figure 3 Comparison of pulmonary vein partial pressure of oxygen, pulmonary artery pressure and lactic acid level between two groups

2.3 两组供肺形态学分析

HE染色结果显示，A组肺泡结构大量破坏，细胞数量稀少（图4A），B组肺泡结构相对正常，未见明显细胞水肿（图4B）。TUNEL染色结果显示，A组供肺细胞阳性反应较强，细胞凋亡较多（图4C），而B组供肺未见明显细胞凋亡现象（图4D）。

图4 两组供肺的病理学表现及细胞凋亡情况Figure 4 Pathological findings and cell apoptosis of donor lung in two groups

2.4 两组供肺炎症标志物水平比较

与灌注1 h比较，两组灌注4 h后MCP-1、IL-6水平均升高，IL-4均降低（均为P＜0.05）。TNF-α、IL-1α和iNOS变化无统计学意义（均为P＞0.05）。两组间各指标在不同时间点的比较，差异均无统计学意义（均为P＞0.05，图5）。

图5 两组供肺炎症标志物水平比较Figure 5 Comparison of inflammation marker levels of donor lung between two groups

3 讨 论

DCD供器官的利用一直是器官移植领域的难点，循环衰竭所致热缺血不仅会导致热缺血损伤，还会增加器官对缺血-再灌注损伤的易感性[4]，在肺移植中尤为明显。虽然EVLP的应用使DCD肺移植成为可能[16-17]，但仍存在原发性移植物失功发生率高等问题[18-19]。本实验发现向灌注液中加入IL-10，可改善心脏死亡大鼠EVLP后供肺的功能。与A组比较，B组供肺外观和组织形态明显较好，乳酸含量较低，表明供肺组织细胞代谢状态更好；D/W比值较高，说明供肺组织损伤较小[20]。

一直以来认为IL-10可通过抑制过度的炎症反应，上调先天性免疫，促进组织修复，减少组织损伤，在感染和炎症反应过程中发挥维持组织稳态的重要作用[21-23]。在体内，IL-10可通过抑制促炎因子和抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）以及其他途径对髓系细胞起抑制作用。IL-10还可通过直接抑制记忆性辅助性T细胞（helper T cell，Th）17和Th2，促进 Foxp3+调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg），减轻炎症反应和组织损伤[24-25]。IL-10信号通路受损与炎症性疾病相关，在感染期间通常伴有免疫异常。相反，IL-10水平升高或失调可能导致慢性感染。在某些情况下，IL-10具有免疫刺激功能，如提高肥大细胞、B细胞和T细胞的活性。也有研究认为IL-10可通过提高组织细胞对髓系细胞来源细胞因子的敏感性促进细胞凋亡[26]。研究表明，IL-10改善EVLP后供肺的功能与先天性免疫无关[11]。本实验中，两组灌注液中促进髓系细胞分化、增殖的IL-4和MCP-1，促炎因子IL-1α、iNOS、TNF-α，调节自体免疫的IL-6水平比较，差异均无统计学意义，说明IL-10对先天性免疫无影响。TUNEL染色结果显示，灌注液中添加IL-10可以减轻肺泡细胞凋亡，表明IL-10可能是通过直接抑制细胞凋亡而发挥作用。也有研究证实IL-10可通过抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB通路减轻脑梗死后的神经元损伤[27]。综上所述，在EVLP系统中，IL-10对DCD供肺的利用有积极作用，可能与IL-10抑制供肺组织细胞凋亡有关，但其作用机制仍需进一步研究。今后将继续研究其作用机制，为增加DCD供肺的利用率提供方向，进一步扩大供体库。