不同浓度七氟醚预处理对小鼠心肌缺血/再灌注损伤后血浆脂联素水平的影响

张琛琳,翟津津,王春晖,刘小霞,刘少凯,张彦清

(1山西医科大学麻醉学院麻醉教研室,太原 030001;2山西医科大学第一医院麻醉科;*通讯作者,E-mail:sxtyzyq@sina.com)

随着人口老龄化日渐加重,急性心肌梗死的发病率逐年增加。尽早恢复缺血区的血流灌注是治疗的首要目标,然而再灌注会对心肌造成进一步损伤[1]。因此,如何减轻心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤成为临床研究的一个重点。目前,挥发性麻醉剂七氟醚已被证明可以减轻MI/R损伤[2]。陈洪涛等[3]发现七氟醚的心脏保护作用与其吸入浓度有关。此外,脂联素(APN)是一种主要由脂肪组织分泌的细胞因子。研究表明,脂联素具有心脏保护作用,血液中的高脂联素浓度降低了心肌梗死发生的风险[4,5]。本课题组前期实验已经证明,七氟醚预处理对MI/R的保护作用可能与其增加血浆脂联素浓度有关[6]。但是,不同浓度七氟醚预处理是否会影响机体脂联素水平,目前尚未阐明。本研究拟通过动物实验,探究不同浓度七氟醚预处理对小鼠MI/R损伤后血浆脂联素水平的影响,以期为七氟醚的临床应用提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康成年SPF级雄性C57小鼠60只,鼠龄8-10周龄,体质量20-25 g,购自山西医科大学动物实验中心【许可证号SCXK(晋)2015-0001】。所有小鼠实验前禁食6 h,不禁水。本实验经动物医学伦理学委员会审核通过。

1.2 主要试剂与仪器

七氟醚(国字准药H20070172,上海恒瑞医药有限公司);伊文思蓝(E713BA0028,上海生工生物工程有限公司);2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(E614BA0011,上海生工生物工程有限公司);小鼠脂联素酶联免疫双抗夹心法试剂盒(EK0596,武汉博士德生物工程有限公司);Harvard小动物呼吸机(美国Harvard公司);酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 动物分组与处理

将60只C57野生型小鼠随机分为5组,每组12只:空白对照组(control)、1%七氟醚预处理组、2%七氟醚预处理组、3%七氟醚预处理组、4%七氟醚预处理组。每组分别按不同时间点(0,6,12,24 h)分为4个不同小组,每组3只。

空白对照(control)组:将单只小鼠放入麻醉诱导箱中,按照2 L/min的体积流量通入氧气75 min。七氟醚预处理组:将单只小鼠放入麻醉诱导箱中,按照2 L/min的体积流量分别通入不同浓度(1%,2%,3%,4%)的七氟醚与氧气的混合气体10 min后,通入纯氧,15 min后换回混合气体,如此循环3次。预处理结束后,立即建立MI/R模型。

1.4 MI/R模型建立

参考文献[7]制备小鼠心肌MI/R模型。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠,待小鼠不能自主翻身,将其头及四肢固定于实验台,直视下气管插管,连接呼吸机,于小鼠左侧第四、五肋间水平纵切1 cm切口,分离开胸大肌、胸小肌等结构,暴露心脏,在左心耳下方约2 mm处穿线,结扎冠状动脉左前降支主干。若看到左室前壁及心尖变白,表明结扎位置正确。缺血30 min后松开结扎线,关胸,模型建立完毕。通过伊文思蓝/2,3,5-氯化三苯基四氮唑(Evans Blue-TTC)染色证明建模成功。

1.5 血浆脂联素水平检测

再灌注后各小组分别于0,6,12,24 h由颈总动脉采血0.5 ml,4 ℃、3 000 r/min离心10 min后,取上清,严格按照试剂盒说明测定脂联素水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 MI/R小鼠心肌伊文思蓝-TTC染色

MI/R建模24 h后,对小鼠心肌行伊文思蓝-TTC染色,观察到非缺血区呈蓝色,缺血区内的非梗死区呈红色,而梗死区呈灰白色(见图1),证明建模成功。

蓝色代表正常血运区,红色代表缺血区,白色代表梗死区图1 MI/R小鼠心肌伊文思蓝-TTC染色Figure 1 Evans blue TTC staining of myocardium in MI/R mice

2.2 各组小鼠血浆脂联素浓度比较

再灌注0 h后,与空白对照组相比,各浓度七氟醚预处理组血浆脂联素水平差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。再灌注6 h后,与空白对照组相比,1%七氟醚预处理组、2%七氟醚预处理组、3%七氟醚预处理组血浆脂联素水平显著增加,而4%七氟醚预处理组血浆脂联素水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与1%七氟醚预处理组相比,2%七氟醚预处理组、3%七氟醚预处理组血浆脂联素水平差异无统计学意义(P>0.05),4%七氟醚预处理组血浆脂联素水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。再灌注12 h后,与空白对照组相比,1%七氟醚预处理组、3%七氟醚预处理组血浆脂联素水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),而2%七氟醚预处理组、4%七氟醚预处理组血浆脂联素水平差异无统计学意义(P>0.05);与1%七氟醚预处理组相比,2%七氟醚预处理组、3%七氟醚预处理组、4%七氟醚预处理组血浆脂联素水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。再灌注24 h后,与空白对照组相比,1%七氟醚预处理组、2%七氟醚预处理组、3%七氟醚预处理组组血浆脂联素水平显著增加,而4%七氟醚预处理组血浆脂联素水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与1%七氟醚预处理组相比,2%七氟醚预处理组、3%七氟醚预处理组、4%七氟醚预处理组血浆脂联素水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。

与control组相比,*P<0.05;与1%七氟醚预处理组相比,#P<0.05图2 各组小鼠血浆脂联素浓度比较Figure 2 Comparison of plasma adiponectin level between groups

3 讨论

急性心肌梗死是一种临床上常见的心血管疾病,然而通过血管再通恢复血运后可导致MI/R损伤。MI/R损伤的病理生理过程受到多种机制的调控,但到目前为止,临床上仍缺乏可显著减轻MI/R损伤的方法[8]。

术中应用具有心肌保护作用的麻醉药物,是一种简单便捷的方法。许多研究表明,挥发性麻醉剂如七氟醚、异氟醚和地氟醚都具有心脏保护作用[9-12]。七氟醚作为一种新型挥发性麻醉剂,其血/气分配系数较低,麻醉诱导过程平稳、快速,安全性强,因此被广泛应用于临床。陈洪涛等[3]发现与1%的七氟醚相比,2%-4%的七氟醚后处理改善了I/R后心肌的收缩和舒张功能,减少心肌梗死面积,说明适宜的麻醉浓度是产生心肌保护作用的关键。然而,既往研究对于七氟醚的心肌保护作用是否具有浓度依赖性尚存在争议[13-16]。Obal等[13]发现1.0MAC(2.4%)的七氟醚对大鼠有最大的心肌保护作用;Wang等[14]认为,与0.75MAC比较,1.0MAC(2%)和1.5MAC的七氟醚对行冠状动脉旁路移植术的患者具有明显的心肌保护作用;而郭圣东等[15]和阳子华等[16]则认为2%浓度七氟烷预处理或后处理产生的心肌保护作用优于1%和3%浓度。因此,探究七氟醚产生心肌保护作用的最佳浓度意义重大。

此外,大量动物实验表明,脂联素可显著保护心脏免受I/R损伤[17,18],血浆中总脂联素水平与急性心肌梗死风险呈负相关[19]。本课题组前期实验证明,七氟醚预处理对MI/R的保护作用可能与其增加血浆脂联素浓度有关[6]。但是,不同浓度七氟醚预处理的心脏保护作用与脂联素水平是否具有相关性,目前尚未阐明。因此,我们拟通过动物实验探究不同浓度七氟醚预处理是否会影响小鼠MI/R损伤后的血浆脂联素水平。结果表明,再灌注后低浓度(1%-3%)七氟醚预处理可显著增加小鼠血浆脂联素水平,而高浓度(4%)七氟醚预处理则会显著降低血浆脂联素水平,且1%的七氟醚预处理可产生最大浓度的脂联素,或许可以发挥最佳的心脏保护作用。

此外,研究发现,血浆脂联素的浓度变化也与再灌注时长有关[20]。Lau等[20]认为,再灌注后3 h,血浆脂联素水平开始下降(再灌注后24 h达到最低点),再灌注后7 d恢复到未行MI/R的对照组水平。本研究也观察到相同趋势,在24 h内,随着再灌注的时间增加,血浆脂联素水平逐步降低。

本研究中发现,七氟醚预处理可增加小鼠脂联素水平的有效范围较窄,而高浓度七氟醚反而会降低机体脂联素浓度,可能对心肌产生负面影响,这提示七氟醚的心肌保护机制是复杂的,在临床工作中应注意恰当地发挥七氟醚的保护作用。本实验样本量较少,这可能会影响实验结果。此外,不同的七氟醚处理时间、处理方式对脂联素水平以及心肌保护作用的影响仍有待后续实验阐明。

总之,本实验发现,低浓度七氟醚预处理(1%-3%)可增加小鼠心肌缺血/再灌注损伤后的血浆脂联素浓度,而高浓度七氟醚预处理(4%)则相反,这种改变可能与七氟醚的心肌保护作用有关。这一发现有望为临床使用七氟醚改善MI/R损伤提供理论基础。