磷酸甘油酸变位酶5调控细胞焦亡在肝脏缺血-再灌注损伤中的作用

乔兵兵 李世朋 宋浩森 季敏 赵龙栓

肝脏缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是常见的临床问题，其发生机制错综复杂[1-3]。细胞焦亡是一种依赖于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase），并伴有大量促炎因子释放的程序性细胞死亡，在细胞损伤、炎症反应等病理生理过程中具有重要作用[4-5]。研究发现细胞焦亡可参与肝细胞的损伤与修复[6]，但磷酸甘油酸变位酶5（phosphoglycerate mutase 5，PGAM5）调控细胞焦亡参与肝脏 IRI的分子机制并不明确。本项目通过研究PGAM5/Caspase-1/Gasdermin D（GSDMD）信号通路调控细胞焦亡的分子机制，以明确PGAM5调控细胞焦亡在肝脏IRI过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

雄性C57小鼠30只，体质量（22.0±2.0）g，清洁等级为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，由郑州大学第一附属医院实验动物中心提供。小鼠正常肝细胞AML12细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK购于上海蓝木化工有限公司，PGAM5 小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）及 siRNA 阴性对照（siRNA-negative control，siRNA-NC）均购于广州锐博生物公司；PGAM5、NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、Caspase-1、 裂 解Caspase （cleaved Caspase）-1、GSDMD与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购于英国Abcam公司；蛋白定量试剂盒、RNA反转录试剂盒均购于北京百普赛斯生物科技有限公司；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α试剂盒、白细胞介素（interleukin，IL）-1β试剂盒、免疫组织化学（免疫组化）试剂盒及免疫荧光试剂盒均购自郑州赛默斯生物科技有限公司。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）试剂盒购于德国 Roche公司。四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒购于美国Sigma公司。

1.2 小鼠肝脏IRI模型建立与分组

建立小鼠肝脏IRI模型的方法参考文献[7]，缺血1 h后松开血管夹，然后关闭腹部切口。再灌注时间分别设置为 6 h（6 h 组）和 12 h（12 h 组），并设立假手术组（Sham组），每组10只小鼠。小鼠再灌注6 h、12 h取血清后脱臼处死，收集肝组织。血清用于生化指标检测，肝组织用于病理学检查、免疫组化、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、蛋白质印迹法等实验。

1.3 细胞培养、处理与分组

将状态良好的AML12细胞以1×105/孔接种于培养板，待其贴壁，参考文献[8]建立AML12细胞IRI模型（IRI组）。采用5 μM Z-YVAD-FMK 预处理AML12细胞，再建立肝细胞IRI模型（抑制剂组），并将未处理的AML12细胞作为对照组，用于分析抑制Caspase-1活性对肝细胞焦亡的影响。

采用脂质体3000将PGAM5 siRNA（siRNA组）和siRNA-NC（siRNA-NC组）转染至AML12细胞，再建立肝细胞IRI模型，并将未处理的AML12细胞作为对照组，用于分析PGAM5调控细胞焦亡对AML12细胞IRI的影响。

1.4 实验方法

1.4.1 酶联免疫吸附试验 小鼠建模完成后取血清，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）试剂盒检测 TNF-α、IL-1β、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.4.2 病理学检查 小鼠肝组织标本采用10%多聚甲醛等渗溶液固定，采用梯度酒精脱水、二甲苯透明，制作肝组织石蜡块后切片，进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.4.3 TUNEL染色 肝组织石蜡切片常规去蜡、水洗，蛋白酶 K 37 ℃孵育 15 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗后添加TUNEL反应混合液，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗后于正置荧光显微镜下观察并拍照。

1.4.4 免疫组化染色 石蜡切片经脱蜡、水化以及抗原修复后，Caspase-1及PGAM5抗体4 ℃湿盒中孵育12 h，滴加免疫组化试剂盒工作液，3,3′-二氨基联苯胺（3,3′-diaminobenzidine，DAB）显色，显微镜下观察并拍摄，阳性细胞染色呈棕黄色。

1.4.5 RT-qPCR 提取各组小鼠肝组织总 RNA，采用RT-qPCR检测IL-1β、PGAM5信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA）的表达。

1.4.6 免疫荧光染色 AML12细胞处理后采用10%多聚甲醛等渗溶液固定，PBS漂洗后GSDMD一抗4 ℃湿盒中孵育12 h，加相应免疫荧光二抗，PBS漂洗后于荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.4.7 蛋白质印迹法 提取各组小鼠肝组织蛋白，检测肝组织PGAM5、GAPDH的表达，提取各组AML12细胞蛋白，检测PGAM5、cleaved Caspase-1、GSDMD、NLRP3、GAPDH的表达。一抗4 ℃孵育12 h，加相应二抗37 ℃孵育1 h，进行X线片曝光，显影、定影。

1.4.8 MTT 检测细胞存活率 将各组 AML12 细胞以1×104/孔接种于96孔板，培养20 h时每孔加入5 mg/mL MTT 溶液 20 μL 继续培养 4 h，弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液 200 μL，震荡 5 min 后酶标仪检测 490 nm 处每孔的吸光度（absorbance，A）值。细胞存活率=处理组A值/对照组A值×100%。

1.5 研究方法

分析IRI对小鼠肝组织和血清学指标的影响；分析小鼠肝脏IRI过程中PGAM5、Caspase-1的表达情况；分析抑制Caspase-1活性对细胞焦亡的影响；分析PGAM5调控细胞焦亡对AML12细胞IRI的影响。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，对于符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Newman-Keuls检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IRI对小鼠肝组织和血清学指标的影响

6 h组和12 h组小鼠肝组织中部分肝细胞水肿，肝窦区变窄，中央静脉充血，偶见点灶状坏死等，且12 h组较6 h组病变加重（图1A）。与Sham组比较，6 h组和12 h组小鼠血清ALT、AST水平均升高，且12 h组高于6 h组，差异均有统计学意义（P＜0.01～0.05，图1B、C）。与Sham组比较，6 h组和12 h组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高，且12 h组较6 h组下降，差异均有统计学意义（P＜0.01～0.05，图1D、E）。与Sham组比较，6 h组和12 h组小鼠肝组织IL-1β mRNA 相对表达量均升高，12 h 组低于 6 h组（P＜0.01～0.05， 图 1F）。 与 Sham 组 比 较，6 h组和12 h组小鼠肝组织中细胞凋亡率均升高，12 h组较6 h组减少，差异均有统计学意义（均为P＜0.01，图1G、H）。

图1 各组小鼠肝组织和血清学指标的表现Figure 1 Manifestations of the indexes of liver tissues and serology of mice in each group

2.2 PGAM5及Caspase-1在小鼠肝脏IRI过程中的表达

与Sham组比较，6 h组和12 h组小鼠肝组织PGAM5 mRNA相对表达量及蛋白相对表达量均升高，且 12 h 组 高 于 6 h 组（P＜0.01～0.05， 图 2A、B）；6 h组和12 h组小鼠肝组织PGAM5、Caspase-1蛋白表达均增多（图2C）。

图2 各组小鼠肝组织PGAM5和Caspase-1的表达情况Figure 2 Expression of PGAM5 and Caspase-1 in liver tissues of mice in each group

2.3 抑制Caspase-1活性对肝细胞焦亡的影响

IRI组 细 胞 NLRP3、cleaved Caspase-1 及 GSDMD蛋白相对表达量均高于对照组，而抑制剂组细胞NLRP3、cleaved Caspase-1及GSDMD蛋白相对表达量均较IRI组下降（P＜0.01～0.05，图3A）。IRI组细胞GSDMD荧光强度较对照组增强，抑制剂组细胞GSDMD荧光强度较IRI组减弱（均为P＜0.01，图3B）。

图3 各组肝细胞焦亡相关蛋白的表达情况Figure 3 Expression of pyroptosis related proteins of hepatocytes in each group

2.4 PGAM5调控细胞焦亡对AML12细胞IRI的影响

为了进一步研究PGAM5调控细胞焦亡的机制，本文采用PGAM5 siRNA转染AML12细胞进行验证。siRNA-NC组细胞的存活率较对照组下降，siRNA组细胞的存活率较 siRNA-NC 组升高（P＜0.01～0.05，图4A）。siRNA-NC组细胞PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量均较对照组升高，siRNA 组细胞 PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量均较siRNA-NC组下降（P＜0.01～0.05，图4B）。siRNA-NC组细胞GSDMD荧光强度较对照组增强，而siRNA组细胞GSDMD荧光强度较siRNA-NC组减弱（均为P＜0.01，图4C）。

图4 各组肝细胞存活及PGAM5/Caspase-1/GSDMD信号通路蛋白表达情况Figure 4 Survival and protein expression of PGAM5/Caspase-1/GSDMD signaling pathway in hepatocytes in each group

3 讨 论

肝脏外科或肝移植手术过程中常需要阻断肝门血管，造成肝脏IRI，引起术后相关并发症[8-9]。肝脏IRI是机制复杂的病理生理过程，是肝脏疾病研究的热点[10-11]。本研究发现，IRI小鼠肝组织PGAM5表达随再灌注时间延长而变化，在基因转录及蛋白翻译水平均显示出差异性，提示PGAM5可能参与了肝脏IRI过程。PGAM5作为一种线粒体膜蛋白，在细胞坏死和凋亡中起关键作用[12]。有研究发现PGAM5可通过调控Keap1介导的Bcl-xL降解调控IRI诱导的心肌细胞凋亡，这可能为治疗急性心肌梗死提供了新靶点[13]。Remijsen等[14]研究发现，在急性炎症性肝损伤中，受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）3可激活 PGAM5，调节动力相 关 蛋 白（dynamin-related protein，DRP）1和 活化 T 细 胞 核 因 子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）去磷酸化，促进促炎因子产生，导致炎症反应发生。本研究发现，IRI小鼠血清TNF-α、IL-1β水平升高，肝组织IL-1β mRNA相对表达量升高。有研究表明，在肝脏IRI中，PGAM5和促炎因子均参与了肝细胞损伤，促炎因子与细胞焦亡密切相关[15]。PGAM5是否可以调控细胞焦亡参与肝脏IRI？笔者未见相关文献报道。

细胞焦亡作为一种程序性细胞死亡方式，广泛参与组织损伤与修复、肿瘤、感染等疾病的发生发展[16-21]。最近的研究表明，移植肾IRI可导致肝细胞焦亡而引起急性肝损伤，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 可 逆 转肝细胞焦亡，减轻肝损伤[22]。二十二碳六烯酸（docosa hexaenoic acid，DHA）通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路下调细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1表达，减少促炎因子分泌，从而减轻肝脏IRI[23]。El-Sisi等[24]发现奥曲肽可下调Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/MyD88/核因子（nuclear factor，NF）-κB/NLRP3通路，抑制 TLR4/NLRP3介导的细胞焦亡，减轻大鼠IRI。甘草酸苷可通过 高 迁 移 率 族 蛋 白 1（high mobility group box 1，HMGB1）依赖的GSDMD调控细胞焦亡以减轻肝脏IRI[25]。

细胞焦亡是由GSDMD调控的细胞炎性坏死，参与了多种疾病的病理生理过程[26]。Caspase-1能够特异性地对GSDMD进行切割，从而产生N-端及C-端蛋白，N-端蛋白片段具有打孔活性，能插入细胞膜形成孔洞，激活细胞焦亡[27-29]。本研究结果显示，在肝脏IRI中，肝组织Caspase-1、PGAM5均表达升高，且随着再灌注时间延长而增多。为验证Caspase-1对细胞焦亡的影响，本文采用Caspase-1抑制剂预处理AML12细胞，再经IRI处理，结果发现细胞 NLRP3、cleaved Caspase-1及 GSDMD 蛋白相对表达量明显下降，GSDMD荧光强度减弱，表明抑制Caspase-1活性可减少肝细胞焦亡指标NLRP3、cleaved Caspase-1及GSDMD表达水平，从而抑制肝细胞焦亡。有研究发现，PGAM5对NLRP3和黑素瘤缺乏因子 2（absent in melanoma 2，AIM2） 炎症小体激动剂IL-1的分泌至关重要，是一种新的炎症小体和Caspase-1活性调节因子[30]。在肝脏IRI过程中，PGAM5是否可以通过调节NLRP3、Caspase-1及GSDMD表达水平调控细胞焦亡参与肝细胞损伤？本研究结果显示，下调AML12细胞PGAM5表达水平后，细胞内 PGAM5、NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD蛋白相对表达量下降，细胞焦亡水平下降。

综上所述，PGAM5/Caspase-1/GSDMD信号通路通过调控细胞焦亡在肝脏IRI中发挥重要作用，对研究保护缺血的肝细胞及减少移植供肝IRI的发生提供新思路。