Banff移植肾病理电子显微镜诊断标准及其进展

黄亚冰 郭晖 官阳 钟伟雄

随着临床器官移植的发展，移植病理学也在不断发展和深入。其中，Banff移植病理学会议（Banff会议）的召开及Banff移植病理学诊断标准（Banff标准）的建立是国际移植病理学发展的重要里程碑。自此之后，移植肾穿刺活组织检查（活检）标本的合格标准及其染色的基本要求，移植肾并发症的基本病理学类型，排斥反应的病理学诊断标准、病变分级及相应的组织病理学评分不断发展和完善，为国际范围内的移植肾活检病理学诊断提供了统一的病理学诊断标准，并且引领了移植病理学相关的基础研究[1]。与此同时，随着对移植肾并发症诊断研究的不断深入，人们逐渐认识到，与肾脏病的临床诊断相似，移植肾并发症诊断不仅需要组织学和细胞学水平的光学显微镜（光镜）观察和免疫荧光等特殊染色，也同样需要亚细胞水平的超微病理学诊断。因此，电子显微镜（电镜）在移植肾活检病理学诊断中的作用日益得到重视，事实也证明电镜在移植肾的并发症尤其是抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）、特定肾小球病等的诊断和鉴别诊断中可以发挥不可缺少的独特作用[2-5]。

1 电子显微镜及其超微病理诊断的基本定义

1.1 电子显微镜的定义

1.2 超微病理学的基本定义

细胞是组成人体组织结构和发挥正常生理功能的基本结构单位，细胞结构和功能的异常则是导致人体各种疾病的前提条件，由此借助显微镜对细胞及其特定组织结构予以观察，成为诊断各种疾病的主要手段，主要包括组织病理学（histopathology）或细胞病理学（cytopathology）。而进一步导致组织和细胞形态学及其功能异常的病理生理学机制中，细胞内亚细胞结构即多种细胞器在不同致病因素的损伤下的改变，则是更为重要的、根本性的机制之一。因此借助电镜这一分辨能力更高的设备，对细胞内的细胞膜、细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、细胞基质以及细胞内包含物和细胞外沉积物等进行精细的观察，是现代医学中对多种疾病进行明确诊断和鉴别的重要途经。籍此，超微病理学（ultrastructural pathology）的基本定义为借助电镜的高分辨能力，观察在不同疾病状态下亚细胞结构的改变以及细胞内、外异常物质的产生与沉积，从而协助对人体各个系统的疾病予以明确诊断和鉴别诊断。而在移植肾活检的病理诊断中，主要可以协助对移植肾的复发性疾病（recurrent disease）、新发性疾病（de novo disease）予以诊断，近年来研究和临床诊断日益明确，在移植肾AMR的早期发现和明确诊断中，电镜可以发挥独特的诊断作用。借助电镜对移植肾肾小球毛细血管袢内皮细胞、基底膜和肾小管周毛细血管基膜等特定部位的精细观察，并与临床移植术后供者特异性抗体（donor specific antibody，DSA）检测和活检组织内补体片段C4d的免疫组织化学染色相结合，可以进一步对急性或慢性活动性AMR予以早期发现和明确诊断，更好地指导临床予以针对性治疗，保障移植肾的长期存活。

2 Banff移植肾病理电镜诊断的研究历程及其主要进展

从1993年移植肾Banff标准的首次建立到2019年Banff会议的召开，各类移植器官病理学诊断的Banff标准得以不断的更新和完善[8]。部分研究观察到在AMR的肾活检中，肾小球炎症细胞的浸润常伴有内皮细胞的增大，造成毛细血管管腔的狭窄或完全阻塞，并确定这是一种内皮细胞损伤和激活的表现，建议把这些特征作为诊断活动性AMR的形态学指标[9-11]。通过电镜的超微结构观察发现，在发生AMR 时肾小球出现内皮细胞肿胀和内皮下间隙增宽，这些改变与后期发生慢性AMR造成的肾小球基底膜双轨征形成相关，因此，这种改变被认为是慢性AMR的最早期表现，这些超微病理学特征可以提示临床疾病处于进展阶段并指导临床给予积极的干预措施[12-14]。

2013年Banff会议首次将活检组织的分子检测作为一项诊断AMR的依据[15]，但当时只有极少数医疗中心具备检测条件，并且研究结果仅仅来自于个别研究中心。既往移植肾的慢性肾小球病变评分主要依靠光镜诊断，此次会议首次明确提出了电镜观察的重要性，并且提倡有条件的移植中心采用电镜对光镜无法确认的早期移植肾肾小球病（transplant glomerulopathy，TG）进行诊断。

2013年Banff会议将移植肾的慢性（chronic，c）肾小球（glomerular，g）病变中cg1分为两个亚型，即cg1a和cg1b。cg1a的形态学改变是：光镜下无基底膜双轨征的改变，但电镜下观察到≥3个肾小球毛细血管基底膜出现部分或整周的双轨征，并伴有相关的内皮细胞肿胀和（或）内皮下间隙增宽；cg1b的形态学改变是：在光镜下有≥1个肾小球毛细血管基底膜出现双轨征，可以发生在1个或多个非硬化的肾小球，如果有条件，建议用电镜证实；cg 2和cg 3评分标准维持不变。会议同时更新了肾小球毛细血管基底膜双轨征的诊断标准：把光镜下肾小球基底膜双轨征从至少涉及10%的毛细血管袢更新为仅单个毛细血管袢出现双轨征即可建立诊断。既往cg评分主要依靠光镜下的诊断，2013年Banff会议强调了电镜观察的重要性，并且建议在条件许可的情况下，将电镜检查纳入常规移植肾活检病理诊断，尤其是DSA阳性的受者，应在肾移植术后3个月或6个月行移植肾活检，以便早期诊断TG并及时给予适当的治疗。

TG受者的肾小管周毛细血管也可以发生内皮细胞活化和基膜损伤。Monga等[16-17]研究发现，由于肾小管周毛细血管的变化往往与TG同时存在，依据肾小管周毛细血管基膜的多层化可以推断TG的存在或潜在可能性。但也有许多学者认为，肾小管周毛细血管基膜多层（peritubular capillary basement membrane multilayering，PTCML）并不完全是 AMR的特异性改变，有报道称感染后肾小球肾炎、狼疮性肾炎、环孢素肾毒性和尿路梗阻性疾病同样会出现PTCML[18-19]。2013年Banff会议明确了需要通过电镜观察PTCML以诊断慢性AMR。PTCML的诊断标准是：要求1个肾小管周毛细血管基膜层数≥7层以及2个肾小管周毛细血管基膜层数≥5层，同时应避免在斜切面处计算层数。当电镜检测时只观察到1个肾小管周毛细血管基膜层数达到7层时，则还需要2个达到5层的肾小管周毛细血管才能诊断，这是诊断PTCML的最低标准。但如果观察到多个肾小管周毛细血管基膜有7层，则不需要另外2个达到5层的肾小管周毛细血管。

2015年Banff 会议将分子病理学诊断引入到AMR的诊断中，同时成立了 4个新的Banff工作组，其中就包括电镜Banff工作组。与2013年Banff 标准相比，cg1b的诊断标准做了一些细微调整。在此次会议中cg1b的形态学诊断标准是：光镜下受累最严重的非硬化肾小球有1%～25%的毛细血管袢出现基底膜双轨征，建议电镜证实[20]。

在2019年Banff会议上，电镜工作组制定了组织取样及电镜分析cg1a和PTCML的详尽指南[21-26]，建议所有的活检组织尽可能进行电镜取材和包埋制片，特别是怀疑存在肾小球疾病的活检组织。电镜工作组建议对怀疑存在肾小球疾病或其他需要电镜协助诊断的疾病以及存在AMR风险的受者的移植肾活检标本均应进行超微病理观察及诊断。

3 电镜Banff工作组对移植肾活检中电镜诊断的建议

3.1 移植肾活检电镜标本的取材

（1）如果条件允许，建议所有的移植肾活检组织都做电镜取材、固定和树脂包埋，特别是怀疑存在肾小球疾病的活检标本；（2）虽然采用石蜡切片或冷冻切片免疫荧光染色可以检测电子致密物沉积，以及评估一定程度的足突融合，但不推荐用此类标本检测肾小球基底膜厚度、cg1a或PTCML；（3）在所有情况下，均推荐首先进行半薄切片染色及光镜检查[10]。

3.2 超微病理诊断

推荐以下情况进行超微病理诊断：（1）临床、光镜和（或）免疫组织化学染色怀疑存在且电镜可协助诊断的肾小球疾病或其他疾病；（2）有AMR风险的受者，高致敏受者、移植术后任何时间出现DSA阳性和（或）既往活检显示有AMR特征的受者[C4d染色阳性，肾小球炎和（或）肾小管周毛细血管炎 ][10]。

3.3 电镜检查

电镜检查还可用于：（1）检测经活检证实的造成自体肾衰竭的肾小球疾病的早期复发；（2）在移植术后3个月及以上的指征性活检和移植术后6个月及以上的活检标本中，确定是否存在TG的早期变化（cg1a）并早期检测DSA；（3）类似自体原发性肾病的肾活检，对所有病例均应进行肾小球疾病的评估[10]。

3.4 对可能存在AMR的活检标本的评估

对于可能存在AMR的活检标本的评估，按照以下建议评估cg1a和PTCML[10]。

3.4.1 电镜包埋块及切片制备的建议 选择非坏死皮质区，优先观察肾小管萎缩及间质纤维化较少的部位，至少观察1个完整的肾小球，但建议观察的肾小球数目≥2个；至少保留10个肾小管周毛细血管，为此，应适当保留电镜树脂包埋组织块肾小球周围的部分组织，避免仅保留肾小球结构而切削成在顶端仅含有肾小球结构的“锥形”或“金字塔形”。

3.4.2 cg1a的超微病理诊断和报告指南 （1）除外整体或部分硬化的肾小球和严重缺血的肾小球；（2）至少检查1个完整的肾小球，如果条件允许可以检查2个及以上的肾小球；（3）在高倍视野（≥5 000倍）下检查毛细血管袢。

cg1a定义为：光镜下无肾小球基底膜双轨征；电镜下单个肾小球3个以上毛细血管袢显示内皮下新基底膜形成（整周或部分，单层或多层）以及内皮细胞增大和（或）内皮下间隙增宽。报告应说明检查了多少肾小球以及多少个毛细血管袢显示cg1a。

3.4.3 PTCML 的超微结构评估和报告指南 （1）评估肾小球皮质的肾小管周毛细血管的PTCML；（2）除外疤痕皮质、坏死和出血区域；（3）高倍视野（≥5 000倍）下检查至少10个肾小管周毛细血管，计数3个最严重的肾小管周毛细血管基膜层数及其层数最多的节段（沿血管周最严重的区域）。报告应说明检查的肾小管周毛细血管的数量，受影响最严重的肾小管周毛细血管的基膜层数，以及是否达到2013年Banff标准中对慢性AMR的判定阈值（ptcml1：1个肾小管周毛细血管基膜层数≥7层以及2个肾小管周毛细血管基膜层数 ≥5层）。

4 Banff移植肾电镜诊断的基本术语及其病变特征

对光镜和电镜下观察到的独立的肾小球病变，电镜工作组建议尽可能使用与肾脏病理工作组形成共识的特定术语，例如在代表移植肾早期病变 （cg1a）中运用下列这些特定术语：内皮细胞增大（图1A），内皮下间隙增宽（图1B），肾小球内皮下新生致密基底膜（图1C）。

4.1 内皮细胞增大及其定义

内皮细胞增大定义为肾小球内皮细胞胞体增大（图1A）伴有胞质增加、毛细血管管腔面积减少和窗孔消失。不应使用“内皮细胞肿胀”、“反应性内皮改变”、“内皮激活”、“内皮损伤”或“内皮细胞变性”等不准确或不正确的术语。

4.2 内皮下间隙增宽及其定义

内皮下间隙增宽定义为低电子密度的物质使肾小球内皮细胞和肾小球基底膜致密层之间的间隙扩大（图1B），不应使用“内疏松层增宽”或“内皮下疏松”等术语。

4.3 肾小球内皮下新生致密基底膜及其定义

肾小球内皮下新生致密基底膜定义为与原肾小球基底膜明显不同的环状或不连续的单层或多层基底膜（图1C）。

4.4 其 他

因为目前支持的资料很少，其他有关肾小球和肾小管周毛细血管的内皮细胞和基膜的特征暂由病理学家在报告中自行描述。基于电镜Banff工作组的共识，推荐将“肾小管周毛细血管基膜多层”这一专有名词的英文缩写由PTCBMML简化为PTCML。（图1D）。

图1 移植肾特征性病变的电镜表现Figure 1 Electron microscopic findings of characteristic lesions of renal allograft

光镜、免疫病理联合电镜观察，可以为移植肾的病理诊断提供更为全面的形态学依据，在AMR的病理学诊断中，电镜可以更早发现和诊断光镜无法识别的早期TG，可以指导临床及时进行早期的干预治疗，从而更好地保障移植肾的长期存活[27-28]。

5 小 结

电镜观察与诊断已经是移植肾活检组织病理学诊断中不可缺少的有机组成部分。电镜的高分辨能力可以更早发现和诊断移植肾的AMR损伤，同时对移植肾的复发性疾病和新发性疾病的诊断和鉴别也能发挥独特的作用。籍此，2013年Banff会议及随后的历届会议及其Banff诊断标准中均推荐对移植肾活检组织在光镜、免疫病理（免疫荧光）观察的同时，也必须予以电镜诊断，因而能更早、更准确地对移植肾并发症予以诊断和针对性治疗，更好地保障移植肾和受者的长期存活。