构建兔颈总动脉粥样硬化斑块模型的新方法及评价

叶鹏飞郭应坤张怡沈梦婷李湘陈林徐婷文凌仪*

(1.四川大学华西第二医院放射科,出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室,成都 610041;2.四川大学华西医院放射科,成都 610041)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)所致的心血管疾病发病率高,危害性大,是导致脑卒中、冠心病、肢体功能丧失的主要原因[1-2],是世界人口死亡的主要原因[3]。虽然AS的临床和基础研究取得了较大进展,但该病仍然是世界人口死亡的主要原因。构建一种具有创伤小、简单易行、建模时间短、成模率高、典型的颈AS斑块模型,将有助于研究AS斑块的发生、发展、发病机制、综合治疗及决策。因此本研究意在探索一种简单易行的兔颈总AS斑块动物模型的构建方法,为AS模型建立提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

20只(5.0±0.12)月龄健康雄性新西兰的大白兔普通级,体重(2.1±0.63)kg,单笼喂养,室内温度和湿度恒定,自由饮水,昼夜各12 h,由四川大学华西临床医学院动物实验中心提供【SCXK(川)2019-031】,【SYXK(川)2018-011】。将经球囊损伤的右侧颈总动脉作为实验组,将未经球囊损伤的左侧颈总动脉作为自身对照组。所有新西兰大白兔操作均符合四川大学华西临床医学院实验动物福利与伦理委员会(伦理批准号2019149A)。

1.1.2 主要试剂与仪器

4%多聚甲醛溶液(每瓶500 mL,南昌雨露实验器材有限公司);苏木精伊红染色液(每瓶500 mL,南昌雨露实验器材有限公司);二甲苯(每瓶500 mL,南昌雨露实验器材有限公司)。

磁共振仪(Skyra3.0T,德国西门子);数字减影血管造影机(Allura Xper FD20,荷兰飞利浦);动物呼吸机(R520,瑞沃德生命科技有限公司);透射电子显微镜(FEI Tecnai F30,Field Electron and Ion Company);自动脱水机(KD-TS3,金华市宇典医疗器械厂);石蜡切片机(JYD-325,金华市宇典医疗器械厂);生物组织冷冻包埋机(KD-BM,金华市宇典医疗器械厂);穿刺针(24 G,北京安通医疗器械有限公司);微导管(1.8 F,益心达医学新技术有限公司);导引导丝(0.014 in,Boston Scientific Corporation);PTA球囊导管(3 mm×20 mm,Boston Scientific Corporation)。

1.2 方法

1.2.1 球囊损伤兔颈总动脉内膜

(1)术前准备:将实验动物用高脂饲料预喂养4周,术前禁食但不禁水12 h。

(2)手术具体步骤:用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮,按30～40 mg/kg的剂量肌肉注射进行麻醉,约5～10 min后动物进入麻醉状态,用电动剃毛刀剃除右侧兔耳背侧兔毛,充分暴露兔耳中央动脉。将兔左侧卧位固定于DSA机手术台上,用乙醇消毒兔耳,用棉签来回摩擦兔耳中央动脉表面皮肤,力量稍重,扩张兔耳中央动脉,用24 G穿刺针穿刺右侧兔耳中央动脉,退出针芯同时进针鞘,可见鲜红血液流出,注射2 mL肝素水抗凝。将0.014 in微导丝由穿刺针针鞘进入兔耳中央动脉,退出穿刺针鞘,然后用手术刀片于穿刺点处将皮肤切开一个小口,将1.8 F微导管在微导丝的导引下送入兔耳中央动脉,将微导丝弯头转向背侧,在导丝的引导下将微导管依次通过右侧颞浅动脉、颈外动脉、颈总动脉,利用同轴交换技术将3 mm×20 mm球囊送入颈总动脉,约颈椎4～6椎体水平。用碘对比剂充盈球囊至12～14 KPa压力保持60 s,间隔60 s,重复3次,并保持球囊内压力的条件下来回拖动球囊3次。将微导管与球囊进行同轴交换,微导管连接到高压注射器上,流速1 mL/s,流量3 mL,经造影证实颈总动脉扩张成功,取出微导管和微导丝,穿刺点压迫止血,结束介入造模过程(见图1和图2)。

图1 经兔耳中央动脉穿刺入路Note.A.The right central artery of rabbit ear was punctured with a 24 G puncture needle.B.The 0.014 in micro-guide wire was inserted into the central artery of rabbit ear through the needle sheath.C,D.The sheath of the puncture needle was withdrawn,and the 1.8F microcatheter was sent into the central artery of rabbit ear under the guidance of the microguide wire.Figure 1 Puncture through central artery of rabbit’s ear

图2 球囊扩张兔颈总动脉Note.A.The ballon was located at the level of cervical 4～6 vertebral in right common carotid artery.B.Filling balloon with iodine contrast agent(white arrow)dilated the right common cartotid artery.Figure 2 Dilation of rabbit common carotid arty with balloon

(3)手术记录:记录手术准备时间(从肌注麻醉药开始,到开始穿刺血管之前)、穿刺时间、球囊放置时间、压迫止血时间、总的操作时间、出血量及电离辐射剂量,术中出血量通过称重法进行测量[4]。

1.2.2 高脂饲料饲养

经过介入手术行兔颈总动脉内膜损伤的实验兔,再用高脂饲料(1%胆固醇+基础饲料)[5]喂养8周,一日3次,每次饲料量15 g/kg体重,饲料按照体重比例持续增加,依旧单笼喂养,室内温度和湿度恒定,饮水自由,昼夜各12 h。

1.2.3 磁共振仪扫描

用德国西门子公司的Skyra 3.0 T磁共振仪(Magnetic resonance imaging,MRI)进行扫描,采用8通道兔专用线圈。取仰卧位,尾先进,画取兔第4～6颈椎椎体水平进行普通和增强扫描。快速自旋回波T1加权序列(Turbo Spin Echo-Longitudinal relaxation time,TSE-T1WI),TE 10 ms,TR 600 ms,翻转角120°,层厚2 mm,层间距0 mm,FOV 45 mm,矩阵0.44 mm×0.44 mm×2 mm。

数据导入离线工作站(Horos4.0.0.RC1)进行图像后处理,分别测量T1WI横轴位普通和增强扫描图像行双侧兔颈总动脉壁信号强度(signal intensity,SI)和背景噪声的标准差(standard deviation of the noise,SD)。选取血管壁最厚处为感兴趣区(regional of interest,ROI)层面,选取血管壁3个不同位置进行SI的测量,取其平均值,再选取图像边缘无组织处进行SD的测量,计算获得信噪比,计算公式为SNR=SI/SD。

1.2.4 病理组织学检测

将兔麻醉后,用50 mL空气注入兔耳缘静脉处死实验动物,行颈部正中切口约9～11 cm,完整取下主动脉弓和双侧颈总动脉,将标本放入4%多聚甲醛的瓶内固定,进行HE染色。

2 结果

2.1 基本情况

2.1.1 实验动物

本实验成功构建了17只兔颈总AS动物模型,成模率为85.0%(17/20)。

2.1.2 体重变化情况

将未进行高脂饲料喂养的兔在清晨未进食前进行称重,高脂饲料总共喂养12周后清晨未进食前进行称重。高脂饲料喂养前体重为(2.99±0.2)kg,高脂饲料喂养后体重为(3.53±0.21)kg,高脂饲料喂养后体重明显增加(P<0.01)。

2.1.3 手术记录结果

经兔耳中央动脉穿刺入路,行球囊损伤颈总动脉内膜手术各步骤的操作时间的结果:备皮时间(2.77±1.12)min、穿刺时间(4.36±1.48)min、球囊放置时间(13.53±5.19)min、压迫止血时间(2.42±1.03)min、总的操作时间(29.08±5.72)min。术中出血量为(1.21±0.5)mL,电离辐射剂量为(2.68±0.93)mGy。

2.2 血管造影结果

2.2.1 球囊扩张兔颈总动脉后DSA成像结果

所有兔在球囊扩张兔颈总动脉前后,均进行DSA成像,并测量其直径,球囊扩张兔颈总动脉前血管直径(2.28±0.2)mm,球囊扩张兔颈总动脉后血管直径(2.84±0.18)mm,球囊扩张兔颈总动脉后血管直径较前明显增加(P<0.01)。本实验18号兔子,球囊扩张兔颈总动脉前后DSA成像直径如图3所示。

图3 球囊扩张兔颈总动脉前后DSA成像Note.A.The diameter was 2.22 mm before balloon dilation.B.The diameter was 2.82 mm after balloon dilationFigure 3 DSA imaging before and after balloon dilation of rabbit common carotid artery

2.2.2 球囊损伤颈总动脉内膜联合高脂饲料喂养后DSA结果

经球囊损伤兔颈总动脉内膜联合高脂饲料喂养8周后,进行DSA成像,实验组颈总动脉血管直径为(2.75±0.25)mm,自身对照组颈总动脉血管直径为(2.26±0.11)mm,实验组血管直径较自身对照组明显增加(P<0.01)。本实验15号兔子DSA成像后测量左右侧血管直径如图4所示。

图4 兔双侧颈总动脉DSA成像血管直径Figure 4 DSA imaging of rabbit bilateral common carotied artery

2.3 MRI检查结果

图5为T1WI横轴位普通扫描图像;钆类对比剂注入7 min后,T1WI横轴位增强扫描图像上,实验组颈总动脉血管壁增厚,明显强化(白箭),如图5B所示;自身对照组颈总动脉血管壁未见增厚,呈弱强化,如图5A所示。

图5 T1WI横轴位扫描图像Figure 5 Axis T1WI MRI image

2.4 病理对照

2.4.1 大体观察

实验组颈总动脉血管壁明显增厚,僵硬无弹性,呈黄白色;自身对照组颈总动脉血管壁薄,柔软富有弹性,呈粉红色,实验组颈总动脉管径较自身对照组颈总动脉管径明显增粗。

2.4.2 光镜观察

实验组颈总动脉血管壁内膜增厚且不均匀,管腔变窄,内皮细胞不完整排列,泡沫细胞大量聚集,平滑肌细胞大量浸润,紊乱排列;中膜增厚,泡沫细胞较多,平滑肌细胞紊乱排列。自身对照兔颈总动脉血管壁内膜光滑,未见增厚,未见泡沫细胞,中膜平滑肌细胞整齐排列(见图6)。

图6 兔颈总动脉切片光镜图像Figure 6 Microscope image of rabbit common carotid artery

3 讨论

兔的脂蛋白代谢和血管结构与人类非常相似,且对高脂饲料喂养敏感性高,因此常被选为AS斑块模型[6],所形成的AS斑块的病理性质也与人类十分相似[7]。作为中等体型动物,兔具有体型大小适中、饲养方便、取血检查方便及费用较低等优点[8],所以本实验选择中等体型动物家兔作为研究对象。

AS斑块是多种因素形成的结果,单一因素产生的AS可能与人类相比差别较大,采用复合方法构建AS模型越来越受到研究者们的重视[9]。单纯的较长时间的高脂饲养较易在腹主动脉形成AS斑块,但不易在颈总动脉形成粥样硬化斑块,而高脂饲养联合球囊损伤动脉内膜能够成功构建AS模型,球囊损伤动脉内膜的方法不但可以选择AS斑块形成的部位,而且缩短了AS斑块形成的时间[10],许振坤等[11]通过高脂饲养联合球囊损伤动脉内膜在短时间内构建了兔AS斑块模型。

研究表明,高脂血症激活体内的炎症免疫反应,使血管内膜损伤,是AS形成的始动因素[12-13],球囊损伤动脉内膜是通过介入手术将球囊放置在目标血管,通过球囊机械性扩张和拖动破坏动脉内皮细胞[14],使内皮细胞下的外源性凝血物质暴露,血小板凝集在血损伤的血管壁上,能够使AS斑块模型的构建周期缩短[15],并且可以指定病变产生的位置[16],是目前较广泛应用于AS斑块模型构建的方法。

通过球囊损伤动脉内膜的方法构建兔AS斑块模型,通常是通过切开颈外动脉或股动脉的方法将球囊放入目标动脉内,陆红玲等[17]在兔左颈外动脉剪开一“v”形小口成功构建了兔颈总动脉AS模型,张军平等[18]在股动脉壁上剪开一“v”形小口,逆行置入球囊至胸主动脉,成功构建了胸主动脉AS模型。这两种置入球囊的方法都需要切开皮肤,钝性分离局部组织,手术难度系数较大,操作相对较复杂,创伤较大,术后易感染,成模率低[19]。兔耳中央动脉位于兔耳皮下,位置表浅、易于触及、容易观察[20],本研究采用经兔耳中央动脉穿刺入路,行球囊损伤兔颈总动脉内膜,穿刺血管简单,无须经皮切开皮肤,无须钝性分离局部组织,具有创伤小、操作简便以及成模率高等优点,是较好的手术穿刺入路部位。在2016年,刘文贵等[21]报道了经兔耳中央动脉作为穿刺点行肝动脉置管,兔耳中央动脉穿刺入路具有创伤小、操作简便以及成模率高等优点。

本实验通过球囊损伤兔颈总动脉内膜,与AS斑块形成的发病机制内皮损伤学说类似,但是与人体自然形成的AS斑块是不一样的,并且本实验形成的病变血管是扩张的,还不是真正完全模拟人的AS斑块的病理过程。

建立一种与人类AS十分相似的可行性动物模型,对于完善AS相关研究具有十分重要的价值,将有助于对AS斑块的发生、发展、发病机制、综合治疗及决策进行更全面深入的研究。一个好的动物模型不仅需要满足研究人员对该疾病的基本需求,而且需要帮助研究人员拓展研究思路。在未来的工作中,还可能继续尝试诱导不同类型的兔颈总AS病变,包括细胞介导的钙沉积、脂质、纤维性和出血的慢性血管狭窄病变。

综上所述,本文通过兔耳中央动脉穿刺入路,行球囊损伤兔颈总动脉内膜联合高脂饲料喂养的方法成功构建了兔颈总AS斑块模型,该方法具有创伤小、操作简单、可重复性强、造模时间短及成功率高等优点。在穿刺入路选择上,本实验开创性的选择兔耳中央动脉作为穿刺入路,成功构建了兔颈总动脉AS斑块模型,该方法有利于研究者们对AS斑块进行更加深入的研究。