心气虚血瘀证动物模型的构建与评价

2021-07-17王云姣张婉勤张军平吕仕超

中国实验动物学报 2021年3期

王云姣,张婉勤,张军平,吕仕超

(天津中医药大学第一附属医院,天津 300193)

证候是证的外候,是疾病某一阶段病理状态的高度概括,是中医学理论体系的核心内容。证候的物质基础是中医现代化研究的核心。借助多种现代技术手段,统一证候名称,明确辨证分型,规范证候诊断标准,实现证候的标准化更是当务之急[1]。中医学认为“有诸于内,必形诸于外”,证候的宏观表现必定伴随着微观本质的改变[2],而深入探索证候的物质基础,需要借助动物的证候模型。以中医病因病机理论为基础,利用特定致病因素,模拟疾病发生发展的特征,复制与人体证候特点相似的动物模型,是开展中医证候研究的必要条件[3]。动物证候模型是基础和临床相互转化的桥梁,也是中医理论阐明与创新的重要方法。气虚血瘀证是心系疾病的主要证候,其动物模型的研究对诠释中医药防治心血管疾病的科学内涵具有重大意义。因此,本文以心气虚血瘀证动物模型为切入点,梳理其造模与评价的方法,以期促进心气虚血瘀证动物模型的规范化、标准化的进程[4]。

1 心气虚血瘀证的科学内涵

《素问·痿论》云:“心主身之血脉”,心气通过推动和调控血液在脉管内的正常运行以维持人体正常生理功能。《中医临床诊疗术语国家标准(证候部分)》将心气虚血瘀证定义为“心气虚弱,运血无力,心脉瘀阻,以心悸气短,胸闷心痛,神疲乏力,面色紫暗,舌淡紫,脉弱而涩等为常见症的证候”。不同心系疾病气虚血瘀证的特点存在差异,如《急性心肌梗死中西医结合诊疗指南》[5]指出急性心肌梗死气虚血瘀证以胸部刺痛、闷滞,活动后加重,可伴心悸短气,汗出乏力,舌质黯淡或有瘀斑,苔薄白,脉虚无力或弦细无力为特征;《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》[6]指出慢性心衰气虚血瘀证表现为气短/喘息、乏力、心悸为主,兼倦怠懒言,自汗,语声低微,面唇紫暗等,舌质紫暗,苔白,脉沉、细或虚无力;《冠心病稳定型心绞痛中医诊疗指南》[7]指出稳定型心绞痛气虚血瘀证以胸痛胸闷,劳则诱发为特点,症见心悸气短,倦怠乏力,自汗,面色淡白或晦暗,舌黯淡胖大,脉沉涩。研究显示,心气虚血瘀证与心电图、心功能、血流动力学等理化指标密切相关。心气虚血瘀证患者心电图ST段多为上斜型改变,心脏搏出量、心输出量(cardiac output,CO)、心脏指数等明显异常,红细胞压积(red blood cell specific volume,HCT)、纤维蛋白原等明显升高[8]。目前,心气虚血瘀证的研究多局限在以症状、体征、理化指标作为衡量标准,缺乏客观量化的指标,极大地限制了中医现代化的进程。

随着科技进步,中医证候的内涵不断被揭示,运用基因组学、蛋白质组学、代谢组学等技术从生物学层面探讨中医证候的科学内涵[9]。基因组学研究显示,冠脉介入术后气虚血瘀组CYP2C19*2基因突变型与非气虚血瘀组相比显著升高,其突变可通过降低氯吡格雷的抗血小板作用进一步促进气虚血瘀证的形成[10];通过对冠心病心绞痛气虚血瘀证患者的基因集群研究,发现其与内分泌、炎症反应及信号传导等相关[11]。蛋白组学研究显示,在冠心病不稳定型心绞痛气虚血瘀证患者中,铜蓝蛋白、血清淀粉样蛋白、肌球蛋白H11及补体C6呈现高表达,而凝溶胶蛋白、载脂蛋白A4、血红蛋白B及转铁蛋白等6种蛋白呈现为低表达[12];心衰气虚血瘀证大鼠心肌线粒体中Stress-70、Nucleophosmin表达上调而ATP-α表达下调[13]。代谢组学研究显示,心肌梗死恢复期气虚血瘀证患者可能存在能量代谢、磷脂代谢、脂肪酸代谢紊乱,其体内花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱、亚油酸、鞘氨醇类物质的代谢水平均下调[14];不稳定型心绞痛气虚血瘀证患者代谢产物中柠檬酸、氧化三甲胺、高密度脂蛋白等含量高于痰浊痹阻证组,而N-乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、天门冬氨酸等含量相比较低[15]。证候的科学内涵具有隐匿性、动态性和复杂性,与中医治未病、整体观念、辨证论治等理论相通,从基因、细胞、组织等不同层面,运用基因组学、蛋白质组学、代谢组学等方法探讨证候的生物学基础研究,可能进一步丰富气虚血瘀证的科学内涵。

2 单因素诱导的心气虚血瘀证模型

单因素诱导模型[16]是选用一种干预因素复制心气虚血瘀证动物模型,多是通过药物诱导、手术干预、生活环境干预等方式进行造模,复制出临床上与心气虚血瘀证表现一致的模型。

2.1 药物造模法

药物诱导是构建心气虚血瘀证动物模型的重要方法之一。有学者运用去甲肾上腺素、阿霉素、丙基硫氧嘧啶等药物复制心气虚血瘀证模型,通过观察动物一般状态、心脏超声、病理形态评价模型。运用去甲肾上腺素构建兔气虚血瘀型充血性心力衰竭模型[17],结果显示大耳白兔出现呼吸困难、活动减少、食欲不振等气虚症状,左心室收缩压(left ventricular systolicpressure,LVSP)、左室内压变化速率(left ventricular pressure change rate,±dp/dtmax)显著降低,左心室舒张期末压(left ventricular enddiastolic pressure,LVEDP)、HCT、纤维蛋白原明显升高,病理显示部分心肌细胞空泡变性,心肌肌原纤维排列紊乱。运用阿霉素和丙基硫氧嘧啶复制慢性心力衰竭心气虚兼血瘀水肿证大鼠模型[18-19],结果显示大鼠出现精神不振、呼吸频率加快、毛发枯槁、爪甲紫绀等症状,左室内径缩短、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)降低,B型脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、心重指数升高,心肌细胞明显肿胀。

2.2 冠状动脉结扎法

通过结扎大鼠冠状动脉前降支建立慢性心力衰竭模型[20-21],结果显示术后第7天大鼠出现精神倦怠、活动度下降、呼吸频率增加、毛发枯槁、口唇爪甲紫绀等症状,足底RGB值降低,术后第27～30天大鼠旷场实验总运动距离缩短、游泳力竭时间下降,左室收缩末期内径(left ventricular systolic diameter,LVEDs)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、LVEDP、-dp/dtmax升高,左室短轴缩窄率(left ventricular minor axis decurtation rate,FS)、LVEF、LVSP、+dp/dtmax下降,体重、心脏质量、心脏指数明显升高,病理显示心肌坏死明显,胶原纤维弥漫性生长,提示冠状动脉前降支结扎术后第7～28天可以成功诱导慢性心衰气虚血瘀证大鼠模型。

2.3 游泳力竭法

中医学认为“劳则喘息汗出,外内皆越,故气耗矣”,过度劳累易致耗气,日久则致气虚,气虚无力运血导致血瘀。有学者通过游泳力竭模拟过度疲劳复制心肌缺血气虚血瘀证大鼠模型[22],结果显示大鼠出现体重下降、精神萎靡、反应迟钝、游泳时间缩短、爪甲色淡、舌质紫黯等气虚血瘀证症状,心率减慢,异常Q波增多,LVEDs、LVEDd增加,LVEF、FS下降,提示大鼠左心室功能下降[23-24]。

3 复合因素诱导的心气虚血瘀证模型

复合因素诱导模型是采用2种及以上致病因素或中医病因与西医病理相结合的病证结合的方法复制心气虚血瘀证动物模型,与单因素方法相比,复合因素方法更贴合临床实际,是当前数量最多,涉及面最广的一类方法[25]。

3.1 冠状动脉结扎联合其他因素法

病证结合造模可以是在中医“证”的基础上建立西医“病”的模型,根据中医“谷不入半日则气衰,一日则气少矣”、“劳则耗气”等理论,有学者通过冠状动脉结扎联合游泳加控食、睡眠剥夺、高脂饮食等因素构建心气虚血瘀证动物模型,通过观察动物一般状态、心电图、心功能、病理形态评价模型。例如,通过冠脉结扎联合游泳控食法建立冠心病气虚血瘀证大鼠模型[26-27],结果显示大鼠出现精神萎靡、倦怠乏力、毛发枯槁、口唇青紫、舌质紫暗等症状,舌面RGB值下降,旷场实验角落、周边活动时间减少,中心活动时间延长,每搏输出量(stroke volume,SV)、LVEF、组织型纤溶酶原激活剂含量降低,收缩末期容量、舒张末期容量、血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1、血管性假血友病因子含量增高,病理显示心肌细胞排列紊乱,心肌细胞凋亡指数增大[28]。采用冠状动脉结扎术联合睡眠剥夺法可复制心力衰竭大鼠气虚血瘀证模型[29],结果显示大鼠倦怠懒行、毛发脱落、黯淡无光,体重、抓力、脉搏幅度及自主活动下降,舌面RGB值明显降低,CO、SV、LVEF、FS降低,左室收缩末期容积、左室舒张末期容积、左室重量、LVEDs、LVEDd增加。此外,采用冠状动脉结扎术联合高脂饮食法复制高血脂状态的冠心病气虚血瘀证大鼠模型[30],结果显示大鼠呼吸频率加快,旷场内3 min自主运动距离、足底RGB均值下降,术后第7天心电图出现6～8个病理性Q波,术后第7～28天总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇均显著升高,LVEDs、LVEDd增加,LVEF、FS下降,提示该模型在术后第7～14天可辨证为气虚血瘀证模型。

3.2 游泳力竭联合其他因素法

通过强迫游泳可使大鼠出现气虚症状,可在此基础上联合冰水负重法、高脂饮食法等因素构建心气虚血瘀证动物模型。采用冰水负重游泳法建立气虚血瘀证慢性心肌缺血大鼠模型[31],结果显示大鼠心电图ST段抬高总毫伏数最高,肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)明显升高,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)降低,病理显示其心肌梗死面积比例最大。采用力竭游泳联合高脂饮食法[32]构建气虚血瘀证大鼠模型,结果显示大鼠出现毛发干燥易脱落、精神不振、活动度下降、纳差、便溏、眼球暗红、舌绛紫暗、尾部青斑或皮下瘀紫等气虚血瘀症状,肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CKMB)、LDH、MDA升高,SOD降低,研究表明该方法建立的气虚血瘀证模型可用于心血管疾病药物的药效评价。

3.3 其他多因素联合法

根据中医“惊则气乱,劳则气耗”、“寒凝血瘀”、“饥则损气”、“甘肥贵人,则高粱之疾”等理论,多数学者提出采用惊恐、疲劳、寒湿、饥饿、高脂饮食等多因素复合方法复制气虚血瘀证心力衰竭大鼠模型[33-34],通过观察动物的一般状态、血流动力学、血清学指标、病理形态评价模型。通过该方法构建心力衰竭气虚血瘀证大鼠模型,结果显示大鼠出现毛发枯槁、精神不振、活动无力、饮食不佳等气虚症状,心率、收缩压、舒张压、血管紧张素II、肿瘤坏死因子-α、白介素-6水平升高,LVSP、LVEDP等下降,心脏病理显示左心重量、左心质量指数增加,心肌细胞出现水肿、排列紊乱,并伴随炎性细胞浸润,细胞凋亡的阳性反应面积及凋亡指数明显升高[35-36](见表1、2)。

表1 单因素诱导的心气虚血瘀证模型Table 1 Single factor induced heart-qi deficiency and blood stasis syndrome model

4 小结

心气虚血瘀证是心系疾病常见的证候类型,但临床上不同心系疾病的气虚血瘀证的证候表现不尽相同。心气虚血瘀证与多项理化指标密切相关,运用基因、蛋白质、代谢组学等方法探讨证候的生物学基础研究,进一步体现了心气虚血瘀证的科学内涵[37]。证候动物模型研究是推动中医药现代化发展的关键环节,模型评价是其重要内容,通常从模型动物的宏观表现和微观指标进行客观评价,加强了模型科学性、稳定性和可复制性,促进中医现代化进程[38]。但目前其研究仍处于探索阶段,还存在以下不足[39-41]:一是缺乏公认、客观的造模方法,病因造模法尽管可以模拟出所需证型,但人为因素较多导致操作性及稳定性差,而病证结合造模方法虽然符合中医理论与临床,但其操作困难、造模时间长、动物死亡率高,实验可行性差;二是人与动物体质存在差异,人与动物生理机能不同,对病因的敏感性和耐受性不同,不同品种、年龄的动物对同一种造模方法产生的生理反应也不尽相同;三是疾病与证候关联性不强,目前仍以西医造模方法为主,注重现代医学的病理检测,忽视中医证候临床表现,导致疾病与证候关联性不强;四是缺乏标准模型评价体系,目前评价动物模型的标准是建立在人的证候诊断标准上,故在判断模型成功与否时缺少规范化、标准化评价。因此,中医证候模型的建立可以从以下几个方面着手[42-44]:(1)优化造模因素,多采用复合因素造模方法,将中医“证”与西医“病”结合,建立符合中医理论与临床实际的病证结合动物模型;(2)合理选用造模动物,应注重选择与人体生理病理特点相近的动物以更好模拟临床证型,从而提高造模成功率;(3)完善和规范证候动物模型评价体系,可依据中医证候模型研究“生物表征”理论及“因、脉、证、治”建模思路。总之,以中医基础理论为指导,现代科学技术为手段,建立客观化、标准化的心气虚血瘀证动物模型及其评价体系,为疾病的诊疗和预后提供了有力支持,可大大推动中医药现代化发展[45]。