血瘀证动物模型制备的研究进展

刘校彤吕光华王巧稚*王琼

(1.西南医科大学附属中医医院中葡中医药国际合作中心,四川 泸州 646000;2.西南医科大学基础医学院,四川泸州 646000;3.成都中医药大学民族医药学院,成都 611137;4.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

20世纪60年代以来,陈可冀院士课题组在继承传统中医学的基础上,结合现代创新与发展,系统地研究了血瘀证的科学内涵与活血化瘀疗效机制[1]。自此,现代医学对于活血化瘀与血瘀证的研究也就正式拉开了帷幕。传统中医上的血瘀证是指脉管内血行迟滞,或血溢脉外而停蓄体内所引起的证候。随着医学的进步和发展,现代医学主要着眼于血瘀证引起的血液流变学,生化以及组织形态学方面的改变。血瘀证模型的制备,就是建立在传统中医理论和现代医学结合的基础之上。根据血瘀证不同的病因病机,血瘀证模型可以分成:气滞血瘀(qi-stagnancy and blood stasis)、气虚血瘀(qideficiency and blood stasis)、外伤血瘀(trauma and blood stasis)、血虚血瘀(blood-deficiency and blood stasis)、寒凝血瘀(cold and blood stasis)、阳虚血瘀(yang-deficiency and blood stasis)、阴虚血瘀(yindeficiency and blood stasis)、痰浊血淤(phlegm-turbid blood stasis)、热毒血瘀(heat-toxin and blood stasis)、慢性血瘀(chronic blood stasis)本文综述血瘀证模型及研究进展,为血瘀证模型相关科学研究作参考,为活血化瘀药物筛选提供可选模型建议。

1 血瘀证动物模型

1.1 气滞血瘀

气是构成人体和维持生命的基本物质,气为一切的生化本原。气与血都根源于肾中精气,滋生于脾胃化生的水谷精微和肺吸入的清气,故称为“气血同源”。气能生血,气能行血,气能摄血。血能养气,血能载气。气血共同为患,同盛同衰,相互转化。《素问·调经论》说“气血不和,百病乃变化而生”。气滞,则血行不畅,导致血瘀,出现血瘀证候。

(1)单因素刺激模型

章正祥等[2]通过对大鼠血液流速的动态监测,采用肾上腺素皮下注射的方法形成气滞血瘀状态,血流流速明显减慢。通过给实验动物注射肾上腺素来模拟人体情志的变化,影响气机造成气滞血瘀模型。

(2)多因素刺激模型

廖婉等[3]采用连续7 d对大鼠进行肌肉注射10 mL/kg的氢化可的松,联合皮下注射肾上腺素的方法成功复制气滞血瘀模型,通过对全血粘度(whole blood viscosity,WBV),血浆粘度(plasma viscosity,PV),红细胞聚集指数,血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)和血细胞压积(hematocrit,HCT)的检测,显示出醋莪术对气滞血瘀大鼠的改善效果。郑跃等[4]采用不可预知的慢性长期刺激复制气滞血瘀证动物模型,具体包括:每隔8～15 min进行1次,每次60～120 s的对大鼠足底25～35 V的电击刺激;每隔8～15 min进行1次,每次60～120 s的频率为5～15 KHz的噪声刺激(等级为3级),持续10～12 h;每隔8～15 min进行1次,每次60～120 s的频率为1～3 KHz强度的闪烁光刺激,持续10～12 h;进行每小时1次持续4 min的夹尾,每天8次;进行连续21 d,每日1次45°倾斜鼠笼2 h。通过对TNF-α、TLR2基因与蛋白的表达检测,显示出膈下逐瘀汤加减方对气滞血瘀大鼠的确切疗效。刘丹彤等[5]采用夹尾、束缚后腿、食用油灌胃联合皮下肾上腺素注射复合造模,具体为:用贴有纱布的止血钳夹鼠尾,使动物保持激惹争斗状态,每周1次,每次2 min;绷带束缚大鼠后肢使之行走困难,每周1次,每次30 min;食用油(0.01 mL/g)灌胃,每周1次;每只大鼠0.2 mL(1 g/L)肾上腺素皮下注射,每周1次。以上操作1周内交替进行。通过检测多巴胺(dopamine,DA)、去甲肾上腺素(noradrenaline,NE)的含量,显示气滞血瘀证的体内变化,提示模型复制成功。

1.2 气虚血瘀

气虚主要由于体内元气不足而引起的,元气不足导致气虚,使运血无力,血行变缓,从而引起血性不畅导致血瘀。从病因上思考,致气虚的因素有:(1)体虚致气虚;(2)生气之源减少;(3)正气消耗增加;(4)情志失调致气虚[6]。将以上几点转化为造模因素则有:饥饿、力竭、惊恐、疲劳等因素。

(1)单因素刺激模型

扈新刚等[7]在“劳则耗气”的理论基础上,使用游泳力竭的方法造模,力竭的标准为:大鼠沉入水中10 s不能自行浮出水面。可见大鼠精神差、活动减少、体重下降、反应迟缓等表征,检测凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)出现缩短,血浆粘度升高。徐海蓉[8]采用游泳力竭的方法造模,具体为将大鼠放入恒温水槽中游泳14 d,每次持续时间为50%的大鼠出现自然沉降。造模后,大鼠出现毛色暗淡,舌质紫暗,活动减少。检测血浆血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和脑组织一氧化氮(nitric oxide,NO)含量,都表现出升高的现象,提示造模成功。而“劳则耗气”的方法除了游泳力竭之外,还有疲劳跑步运动法。根据这个理论,黄烁等[9]采用疲劳跑步运动的方法造模。具体是让大鼠在跑台水平状态中进行每天1次为期2周中等强度的跑步运动,观察到大鼠出现精神萎靡、被毛无光、活动度降低、大便稀,鼻尖、口唇、舌面均发生不同程度的紫暗。呼吸幅度和脉搏都显著下降,检测见全血粘度切变率均出现升高。王磊沙等[10]采用每天睡眠剥夺16 h(每天16:00～8:00)的方法造模。舌面可见散布的瘀点,舌下脉络紫暗,便溏。检测可见全血粘度切变率均明显升高,PT缩短。

(2)多因素刺激模型

许颖智等[11]选用饥饿、疲劳和寒湿刺激的因素造模,具体为:根据体重计算,给予大鼠40 g/kg的饲料,在室温(15±1)℃下,强迫大鼠游泳至疲劳,平均(10±5)min后,不予以保温任其晾干。可观察到大鼠倦怠萎靡、毛发稀疏呈黄白色、反应慢、胸前皮肤颜色淡暗。检测可见血小板聚集率(platelet aggregation rate,PAG)升高,血浆颗粒膜蛋白-140(plasma granule membrane protein-140,GMP-140)水平升高,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)水平降低。任建勋等[12]使用日夜颠倒+不可预知的慢性睡眠剥夺复合半高脂高糖饮食的方法造模。具体为:在半高脂高糖饲料喂养的基础上,使用常相光照(8:00～20:00光照,20:00～8:00黑暗)、反相光照(8:00～20:00黑暗,20:00～8:00光照)、持续光照(24 h光照)及持续黑暗(24 h黑暗)4个过程(为1个阶段),每个阶段7 d,连续重复6周,在每个阶段中随机安排以上4个过程,每个阶段对大鼠进行48 h的睡眠剥夺,当大鼠进入睡眠时,给予低压电刺激,使大鼠保持清醒无法进入睡眠状态。检测见全血粘度低切变率、血清总胆固醇(total cholesterol,TC)与低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C)都出现显著升高,血浆血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)含量,内皮素(endothelin,ET)含量明显升高。张玉昆等[13]选取老年大鼠复合一次性向气管内注射博来霉素制备模型,检测可见全血粘度低中切变率升高,血小板体积分布宽度(platelet volume distribution width,PDW)和血小板平均体积(mean platelet volume,MPV)升高,环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平降低,环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)水平升高,TT和PT缩短,血小板因子4(platelet factor 4,PF4)水平和纤溶酶原激活抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)水平升高。彭桂原等[14]使用耗气破气加饥饱失常法共15 d造模,具体为:采用“足量给食-限量给食”的循环方法,使用“小承气汤”作为破气苦降药,给药当天禁食,次日自由进食。造模后,观察到模型组豚鼠精神萎靡,行动迟缓,便溏,被毛有不同程度枯槁脱落,检测发现血清D-木糖的浓度降低,病理检查corti器的内毛细胞,发现毛细胞有变性、坏死和缺失的情况。

1.3 血虚血瘀

气血同源,“气为血之帅,血为气之母”。血虚则气虚,气虚则血行不利形成瘀证。常复蓉等[15]采用股动脉放血的方法制备模型,每天放1.5%的血量,总放血量为家兔自身总血量的50%左右。放血结束后检测结果与放血前对比可见,家兔的红细胞总数、血红蛋白(hemoglobin,HB)降低,WBV和PV升高,HCT降低,红细胞变形能力下降;TT和PT降低,纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)升高;NE降低,酸性α-萘乙酸酯酶(acid-naphthoacetate esterase,ANAE)降低,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)降低,TXB2升高。金翔等[16]采用皮下注射乙酰苯肼和腹腔注射环磷酰胺的方法复制模型,具体为:对大鼠在第1天和第3天时,以0.005 mL/g的剂量皮下注射乙酰苯肼,第3天注射后2 h,腹腔注射0.005 mL/g的环磷酰胺,此后连续3 d行同剂量的环磷酰胺腹腔注射。微循环图像分析仪观察可见,大鼠耳廓微血管血流量降低,血流速减缓。

1.4 外伤血瘀

由例如创伤、跌打损伤及金刃损伤等多种原因所致的脉管破损,致使血溢于脉外,成为离经之血后未能及时消散或排出体外,积聚于体内后而形成淤血。魏荣锐等[17]用铁杵击大鼠右后肢软组织,使之形成外伤血瘀模型,具体为:实验前1 d将大鼠右后肢脱毛并测量其周长,实验当天,以钝器自由落体击伤大鼠右后肢,造成肉眼可见的皮下出血伴有明显肿胀的非开放性软组织损伤,再测量周长并评分。观察损伤部位可见皮下淤血,组织肿胀,肌肉颜色暗红或紫暗。检测可见全血粘度和红细胞聚集指数升高,全血粘度切变率均升高。沈欣等[18]选用击打高度10.5 cm,重1013 g的落体击打仪,自由落体击打大鼠右小腿的中部外侧。可见大鼠真皮及皮下组织,肌外膜、肌束膜和肌纤维间出现不同程度的出血、渗出和炎细胞浸润;肌纤维间距增大、存在不同程度的变性、坏死。

1.5 寒凝血瘀

《医林改错·积块》说:“血受寒则凝结成块”。若外感寒邪入于血脉,或阴寒内盛血脉挛缩,都会导致血液凝涩而运行不畅,故血液在体内瘀积不散,形成瘀血。

(1)单因素造模

王丹丹等[19]采用低温冷冻法:将大鼠放置于0～1℃的冰水20 min,每日1次,连续两周,形成大鼠的寒凝血瘀模型。观察可见大鼠寒战,蜷缩少动,喜扎堆,爪尾部紫暗,耳色暗红,舌质紫暗,舌下脉络增粗增长,便溏。吴卓霖等[20]采用改良暴露法造模,具体为,将大鼠放置于(-10±2)℃的低温冰柜中,使用含91.5%氮和8.5%氧混合气体的气袋,放入冰柜内并缓慢放气,持续1 h后取出,每天1次,连续5 d。观察到大鼠也出现蜷缩少动,食少便溏,被毛无光等体征。检测可见全血黏度切变率,血浆黏度和红细胞聚集指数皆升。唐照亮等[21]通过使用电扇每日4 h低速吹风,营造出3～4级风力、1℃～6℃的风寒环境,使大鼠在此环境中持续低温受冻3周造模。检测可见大鼠血浆ET水平升高,NO水平降低,ET/NO比值增大。

(2)多因素造模

Dang等[22]采用静脉注射去甲肾上腺素加牛血清蛋白复合冰水游泳的方法造模,在第1天和第10天对大鼠静脉注射牛2.5 mg/kg的血清白蛋白,在4～17 d时,每天2次静脉注射0.02 mg/kg的去甲肾上腺素,在第18～24天时,将大鼠放入0℃～4℃的冰水中游泳5 min。检测可见PT、APTT、TT缩短,FIB含量升高,TXB2水平升高,6-keto-PGF1α水平降低,大鼠血浆的血栓素A2(thromboxane,TXA2)和ET水平升高,内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和前列环素(prostacyclin,PGI2)的水平降低。刘丹等[23]采用冰水浴加肾上腺素注射法复制模型,具体是将大鼠连续7 d,每天1次放入0～1℃的冰水中5 min,第8天时,对各模型组大鼠进行2次1%肾上腺素(0.0008 mL/g)的皮下注射,2次间隔4 h。造模后可见大鼠稀便、少动、毛色不荣、爪尾紫暗、尾凉及摄食减少。检测可见全血粘度切变率升高,血浆粘度升高,ET含量升高,NO水平降低,血清IL-6、TNF-2α水平显著升高。贾丹兵等[24]给大鼠皮下注射2次,间隔4 h的0.1%盐酸肾上腺素0.0008 mL/g,第1次注射2 h后将大鼠浸泡在4℃的冰水中5 min造模。检测可见全血粘度切变率升高,血浆粘度升高,红细胞压积明显升高。

1.6 阳虚血瘀和阴虚血瘀

阴阳之间存在对立制约、互根互用、消长平衡、相互转化的关系。气分阴阳,可推动和调控血液运行,阳虚则脉道失于温通而滞涩,阴虚则脉道失于柔润而僵化,阴阳失衡则会影响气、血、津液的输布从而形成瘀证。

(1)阳虚血瘀

温瑞兴等[25]采用断食1夜后将大鼠放入-15℃冷冻4 h造成阳虚血瘀的模型,检测可见凝血时间缩短,但未见血浆粘度发生明显变化,提出阳虚是导致机体功能下降区别于有形之瘀的证候。张明雪等[26]采取高脂饮食、寒冷刺激复合脑垂体后叶素注射的方法复制阳虚血瘀证模型。具体为:给予大鼠高脂饲料,将大鼠放于-2℃～-4℃的寒冷环境中持续6周,在第35天,皮下注射脑垂体后叶素(pit,10 U/kg)。造模后,大鼠出现心肌损伤且心功能减退的现象,心电图显示心肌缺血,检测可见血脂和心肌酶升高,血小板聚集率升高。刘如秀等[27]采用甲醛加压注射渗透法建立兔心阳虚血瘀证模型,在心电图监测下,推注0.01～0.02 mL 20%的甲醛直至心率下降30%～50%,或出现心律失常时停止。造模后可见兔体重减少、精神萎靡不振、蜷缩少动、毛色枯槁、舌色暗红或淡紫;可见兔体温下降呼吸频率增高、心率下降、单位时间内游泳速率下降、全血粘度升高、全血粘度切变率升高、红细胞聚集指数升高。

(2)阴虚血瘀

叶宏军等[28]采取氢化可的松联合肾上腺素造模,具体为:对大鼠连续14 d进行肌肉注射10 mg/kg的氢化可的松注射液,在第14天和第15天取血前1 h皮下注射0.5 mg/kg的0.1%肾上腺素。通过检测可见全血粘度切变率均升高,血浆粘度、血沉、红细胞压积和血小板黏附率均升高,血小板聚集率也同样升高。卞慧敏等[29]采用每日皮下注射48 mg/kg的D-半乳糖,第32天开始,再联合肌肉注射1.5 mg/kg地塞米松的方法,共39 d完成造模。经检测大鼠的PT、APTT出现明显缩短,血小板聚集率升高,血浆PGI1α水平降低,TXB2和ET升高。

1.7 痰浊血淤

津液和血均来源于精气,在运行输布中相互转化,且都具有滋润濡养的作用,《内经》曰:津入脉管,变化而赤是谓血。可见津可入血,血可成津,二者相辅相成,一荣俱荣,一损俱损。血液不循常道成瘀,而津液不循常道则成痰浊。张蕾等[30]采用颈动脉针控线拴法、维生素D3注射结合高脂饮食的方法造模。具体为:在大鼠的颈总动脉旁平行放置直径为0.06 mm的针头,用6号尼龙线将两者扎紧,抽出针头待血流恢复后即可造成一定程度的颈总动脉狭窄。术后第5天,连续3 d对大鼠注射维生素D3,同时给予高脂饲料喂养2～8周,分时间点取材检测。检测可见大鼠血脂和血胆固醇升高,全血粘度、血浆粘度和红细胞压积升高。HE染色可见颈动脉内皮和中膜内有脂滴和泡沫细胞,动脉壁结构破坏,弹力纤维断裂等。王莹威等[31]采用高脂饲料喂养8周的方法造模(配方:胆固醇1%,猪油15%,蛋黄粉15%和基础饲料79%)。检测可见TC、甘油三酯(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著升高,高密度脂蛋白胆固醇水平降低,miR-21和TGFβRⅡ的表达水平明显升高。

1.8 热毒血瘀

《医林改错·积块》所述:“血受热则煎熬成块”。外感火热两邪,或体内阳盛而化火入血,血热互结而煎灼血中津液,则血液黏稠运行不畅;或热灼脉络,迫血妄行使内出血,以致血液滞于体内不散成瘀。杜巧辉等[32]在末次给药5 h后,给大鼠腹腔注射2.5 mL/kg的角叉莱胶溶液,8 h后再经尾静脉注射1 mL/kg的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液,尾部出现明显且肉眼可见的血栓为造模成功。观察大鼠出现反应迟钝、扎堆少动、便溏、四肢瘫软无力。检测发现大鼠白细胞升高,血小板和红细胞降低,红细胞压积、全血粘度和全血粘度低切变率均升高。李妍等[33]采用LPS注射的方法对小鼠造模。具体为:首次以3 mg/kg的剂量经尾静脉注射LPS溶液,20 h后开始以4 mg/kg的剂量行腹腔注射,隔天1次,连续6周。观察可见小鼠食量减少,呼吸频率偏快,耳缘毛细血管变深红甚至紫红,双眼球色暗红,爪甲紫暗。小鼠耳缘血管网、足趾血管网、腹壁静脉局部的血流量均减少,检测可见小鼠血粘度升高,全血粘度低中高切变率均升高。

1.9 慢性血瘀

《内经》说:“六十岁,心气始衰,苦忧悲,血气懈惰。”《医林改错》指出:“元气既虚,必不能达于血管,血管无气,必停留成瘀”。衰老后,元气衰弱,因气血同源,故血行减缓易滞成瘀。毛腾敏等[34]选择24～27月鼠龄的老年大鼠为模型研究,检测全血粘度低、高切变率,血浆比粘度和血清比粘度,出现升高的现象;红细胞电泳速度降低,红细胞变形能力下降,电刺激老年鼠颈动脉后,体内血栓形成时间明显缩短,老龄鼠的体外血栓长度、湿重和干重均有增加,血浆胆固醇含量明显增高。贾景景等[35]采取每日1次,连续7周对大鼠皮下注射100 mg/kg D-半乳糖复制模型。造模后发现大鼠下肢基础微循环灌注量降低,检测可见血小板聚集率、纤维蛋白原和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平均升高,SOD活性降低。

2 实验室评价方法

2.1 模型动物的一般情况

虽然血瘀证的分型很多,但在造模表现上存在着一定的相似性。血瘀证的动物模型,均表现有毛色暗淡无光、舌质暗红或淡紫、运动量减少、精神萎靡、食少便溏、大小鼠可见爪甲紫暗及尾凉蜷缩。

2.2 血液指标选取

血瘀证在血液流变学的改变是现在公认的客观指标,故选择的指标有:全血粘度切变率(WBV),血浆粘度(PV),红细胞压积(HCT),血沉(ESR)。血瘀证也会引起凝血功能的改变,故:血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)也被纳入考虑范围。血液的瘀滞和血栓的形成和血小板相关指标也有关:血小板体积分布宽度(PDW)、血小板平均体积(MPV)、血小板聚集率(PAG)。

2.3 生化指标选取

慢性血瘀证以及高脂饲料喂养的动物模型可有生化指标的改变,故可选取:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)。

2.4 血浆中特定指标的选取

血瘀证的微观病理改变和血管内皮细胞功能损伤关系密切[36]。血浆内皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)、血栓素B2(TXB2)、血管紧张素II(Ang II)、前列环素(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、超敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、血浆颗粒膜蛋白-140(GMP-140)、纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)、降钙素基因相关肽(CGRP)。

2.5 辅助检测

可以选择激光多普勒血流仪,微循环图像分析仪观测耳朵、脚趾、腹部血管的血流值。因为血瘀证和血管内皮损伤存在一定的联系,故可以选择和

血管内皮损伤有关的蛋白进行检测,如:内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)、内皮细胞蛋白C受体(endothelial cell protein C receptor,EPCR)等。r

表2 模型表现和指标Table 2 Model performance and indicators

2.6 组织形态学观察

可以通过取动脉做苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),观察对比实验组的血管内皮形态;还可选择电刺激大鼠颈动脉产生血栓的方法,通过测量血栓的长度,干重和湿重来评价实验用药的效果。

3 模型特点

血瘀证模型因其病因病机较多,故而出现较多分型和造模方法,不同造模方法的原理,造模周期和模型表现以及相关的指标选取也有一些差异,在此将前述各模型相关内容进行汇总(见表1、2)。

表1 血瘀证模型相关内容汇总Table 1 Summary of related content of blood stasis model

4 小结与展望

近年来,随着对血瘀证研究的不断深入和完善,血瘀证的动物模型得以改进和充实,其造模原理也主要体现在病因病机与证候的结合。所有的血瘀证动物模型,在血液流变学上都体现出了“粘”、“浓”、“凝”、“聚”的特点。血瘀证常夹杂多种证候出现,用单一的刺激因素作用于模型并不能完全满足实际需要,故而现在常选择多因素复合刺激进行血瘀证的模型复制。这样的模型既符合中医对于血瘀证的诊断,又能在现代医学的血液流变学上得到体现。

然而,现在的模型虽然可以模拟一部分证候,但在临床上血瘀证常因气血两虚,情志失调导致气机紊乱,以及环境因素相互作用而产生。目前已有模型还难以将血瘀证杂糅的证候完全体现,在这一点上还需进一步探索。再者,血瘀证模型常需通过施加病理因素诱发产生,这与人类的实际发病情况并不完全一致,另有一部分自然成瘀的模型耗时较长难以模拟。对于今后的模型复制而言,延续和改进现有的造模原理和方法,采用较为温和的造模方式仍很重要。在保证动物福利前提下,可通过结合多种因素,例如:在结合环境和模拟人体情志变化复合饮食节律的基础上,延长造模时间等方式,或采用更加贴近人体发病后“久病成瘀”的特点进行造模,可能更为接近血瘀证特点。总之,更科学、合理、接近临床特点的模型制作仍是血瘀证相关研究及活血化瘀药物筛选的关键环节,相信通过更优的模型制作,可为中医药学和现代医学的研究发展提供重要参考。