基于网络药理学的苇茎汤治疗非小细胞肺癌的作用机制研究

谢飞宇，毛 昀，褚雪镭，蔡亚芳，薛 鹏，朱世杰

（1.北京中医药大学研究生院，北京 100029；2.中国中医科学院望京医院肿瘤科，北京 100102）

肺癌是全球死亡率最高的肿瘤，其中约85%的肺癌患者的病理类型为非小细胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）［1］。随着对NSCLC 病、生理机制研究的深入，治疗方式也取得巨大突破，内科治疗手段可归纳为：化疗、靶向治疗、免疫治疗［2］。但是，NSCLC 的总体5 年生存率仍较低，因此，探索新的疾病靶点及药物组合对于治疗NSCLC 具有重要意义［3］。中医药在我国肿瘤治疗领域有着广泛的应用，在改善症状、处理并发症、减毒增效、提高患者生存活质量等方面发挥着关键作用［4］。目前，多种中成药已被证实治疗NSCLC 有效，如华蟾素［5］、斑蝥［6］等。中医药成分丰富，参与调控的靶点、通路众多，因此探索中药在治疗NSCLC 中的作用机制意义深远。

苇茎汤见于孙思邈所著《备急千金要方》，由苇茎、桃仁、薏苡仁、冬瓜子四药组成。其中苇茎甘寒轻浮，善清肺热，《本草逢原》谓其“专于利窍，善治肺痈”，故为君药。冬瓜子清热化痰，利湿排脓，能清上彻下，肃降肺气，与苇茎配合则清肺宣壅，涤痰排脓；薏苡仁甘淡微寒，上清肺热而排脓，下利肠胃而渗湿，二者共为臣药；桃仁活血化瘀，是为佐药。四药合用，共奏清热化痰，逐瘀排脓之功。目前，苇茎汤被用于治疗非小细胞肺癌及相关并发症如上腔静脉综合征、恶性胸腔积液等［7，8］。但是，关于苇茎汤治疗NSCLC 的活性成分和分子学作用机制尚未完全明确，有待进一步探索。

网络药理学作为一门新兴技术，融合了计算机虚拟计算、高通量组学数据分析、多种数据库检索等手段，通过多层次网络阐明药物的化学成分及作用机制，为研究药物与疾病开拓了新的视角［9］。本研究通过检索TCMSP、Swiss Target Prediction、OMIM、Drugbank、TTD 等公共数据库，筛选出苇茎汤的有效活性成分及潜在作用靶点，分析其治疗NSCLC 的关键靶点、生物进程与信号通路，为后续进一步的体内外实验奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 苇茎汤活性成分的收集与筛选

通过传统中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）并结合检索CNKI 数据库、Pubmed 数据库中的相关文献，获得苇茎、桃仁、薏苡仁、冬瓜子四药的化学成分。再将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性指数（drug‐like index，DL）≥0.18 作为进一步筛选的依据。

1.2 苇茎汤活性成分靶点的预测及“中药‐活性成分‐靶点”网络图的构建

利用TCMSP 数据库获取苇茎汤中筛选出的每个活性成分对应的潜在靶点信息，对于没有靶点的成分在PubChem 数据库输入这些成分的InChIKey号码，下载它们的2D 结构简式SDF 文件，上传至Swiss Target Prediction 进行预测，并选取Probabili‐ty 值≥0.7 的高置信度靶点。借助Uniprot（http：//www.uniprot.org）数据库中的UniprotKB 功能，将筛选出的靶点全部校正为标准基因名。删去没有作用靶点的成分，运用Cytoscape3.7.2 软件构建“中药‐活性成分‐靶点”网络图。

1.3 非小细胞肺癌靶点的挖掘

将“non‐small cell lung cancer”作为关键词在以下4 个数据库中进行检索，获得NSCLC 靶点的信息：（1）OMIM 数据库（https：//www.omim.org/）；（2）DrugBank 数据库（http：//www.drugbank.ca/）；（3）GeneCards 数据库（http：//www. genecards.org/），选取前100 个高相关度的靶点；（4）TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）。将所得的靶点进行标准化去重。

1.4 苇茎汤治疗NSCLC 的靶点映射

通过在线绘图软件Venny2.1（https：//bioin‐fogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），制作韦恩图，将苇茎汤所预测的靶点与NSCLC 所对应的靶点进行映射，获取苇茎汤治疗NSCLC 的关键作用靶点。

1.5 交集靶点蛋白与蛋白相互作用网络分析

将苇茎汤和NSCLC 的交集靶点输入在线STRING11.0 数据库（https：//string‐db.org/），以置信度蛋白质参数＞0.7 为条件进行筛选，去掉网络中的孤立节点。将所获得的tsv 格式文件导入Cyto‐scape3.7.2 软件进行可视化分析。同时，借助软件中Molecular Complex Detection（MCODE）插件，对相关靶标数据进行分析，得出苇茎汤治疗NSCLC 的核心靶点。

1.6 交集靶点的GO/KEGG 富集分析

利用Cytoscape3.7.2 软件中的Clue GO 插件进行GO/KEGG 通路富集分析。其中，GO 富集分析可以表明基因靶点分子功能、细胞成分、生物进程。KEGG 分析可体现苇茎汤治疗NSCLC 所涉及的靶点信号通路富集情况，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苇茎汤主要活性成分

以OB≥30%、DL≥0.18 为筛选标准，经标准化去重后总共筛选出33 个有效成分，其中苇茎3 个，桃仁23 个，薏苡仁9 个，冬瓜子2 个，结果见表1。阿魏酸虽不符合筛选标准，因具有抗肿瘤活性，因此纳入。

表1 苇茎汤主要活性成分Tab 1 The main active components of Weijing decoction

2.2 苇茎汤活性成分的靶点预测及靶点网络图构建

借助TCMSP、PubChem、Swiss Target Predic‐tion、Uniprot 数据库，共得到苇茎汤活性成分的靶点85 个。运用Cytoscape3.7.2 软件构建“中药‐活性成分‐靶点”网络图，见图1。

图1 中药‐活性成分‐靶点网络图Fig 1 The network of drugs-active components-targets

2.3 NSCLC 疾病靶点的获取及苇茎汤治疗NSCLC 靶点映射

以“non‐small cell lung cancer”为关键词检索OMIM、DrugBank、GeneCards、TTD 数据库，通过标准化去重后共获得NSCLC 相关靶点619 个。通过韦恩图将苇茎汤所预测的靶点与NSCLC 的靶点进行映射，发现共有54 个交集靶点，即苇茎汤治疗NSCLC 的关键作用靶点，见图2。

图2 苇茎汤‐NSCLC 共同靶点数Fig 2 The number of intersection targets of Weijing decoction-NSCLC

2.4 蛋白质‐蛋白质相互作用信息（PPI）网络构建及核心靶标筛选

结合Cytoscape3.7.2 与STRING11.0 数据库所获得的tsv 文件，构建交集靶点的PPI 网络图，见图3；通过MCODE 插件进行聚类分析，筛选网络图中核心靶点，见图4。连接度（Degree）表示某点与某点连接的边的数目，其值越大，表明该靶点在网络中越重要，在图中所对应的圆圈越大，颜色越深。综合评分用来衡量靶点之间的联系，其值越大，在图像上表现为连线越粗，颜色越深，说明靶点之间联系越紧密。

图3 苇茎汤治疗NSCLC 交集靶点蛋白质相互作用网络图Fig 3 PPI of intersection targets in the treatment of NSCLC with Weijing decoction

图4 苇茎汤治疗NSCLC 核心靶点蛋白质相互作用网络图Fig 4 PPI of hub genes in the treatment of NSCLC with Weijing decoction

2.5 GO 富集分析结果

苇茎汤治疗NSCLC 主要涉及99 个生物进程，见图5。这些生物进程主要与细胞凋亡、细胞核活动、血管调节方面相关。富集分析较集中的生物学过程有：外源性凋亡信号传导（extrinsic apoptotic signaling pathway）、凋亡信号通路中半胱氨酸型内肽酶活性的激活（activation of cysteine‐type endo‐peptidase activity involved in apoptotic signaling path‐way）、凋亡信号通路中线粒体外膜通透性的正调控（positive regulation of mitochondrial outer membrane permeabilization involved in apoptotic signaling path‐way）、核受体活动（nuclear receptor activity）、血管直径的正向调节（positive regulation of blood vessel di‐ameter）。

图5 苇茎汤治疗NSCLC 关键交集靶点GO 分析Fig 5 GO analysis of the key intersection targets of Weijing decoction in the treatment of NSCLC

2.6 KEGG 富集分析结果

对苇茎汤治疗NSCLC 关键靶点进行KEGG 富集分析，共确定49 条相关信号通路，主要涉及肿瘤、细胞凋亡、炎症、抗血管生成、代谢等方面，富集排名靠前的通路主要有肿瘤相关通路、乙型肝炎信号通路、p53 信号通路、细胞凋亡信号通路、VEGF 信号通路、糖尿病并发症的AGE‐RAGE 信号通路等，见图6。

图6 苇茎汤治疗NSCLC 关键交集靶点KEGG 分析Fig 6 KEGG analysis of the key intersection targets of Weijing decoction in the treatment of NSCLC

3 讨论

现代医学对于NSCLC 发生、发展的机制研究取得了重大突破，主要集中在驱动基因突变、抗血管生成、免疫治疗等方面。表皮生长因子受体(EG‐FR）突变是NSCLC 中最常见的驱动基因突变，约见于27% 的肺腺癌患者及9% 的肺鳞癌患者［10］。EGFR 与活化的配体相结合形成二聚体，通过酪氨酸激酶残基的磷酸化激活下游信号通路，参与细胞增殖、生存、侵袭、血管生成［11］。PD‐1 受体是表达在T 细胞表面的具有免疫抑制功能的受体，可与肿瘤细胞分泌的PD‐L1 相结合，使得T 细胞无法识别杀伤肿瘤细胞，引起肿瘤免疫逃逸［12］。基于此，NSCLC 的内科治疗方案也产生了较大变化，从以铂类药为基础的双药化疗为主，发展成化疗、靶向治疗、免疫治疗多方案联合的格局。虽然上述方案取得显著疗效，但仍面临着5 年生存率较低、易产生耐药性和受益人群较窄的问题。古代中医典籍中虽然没有对肺癌的记载，但根据本病的临床表现，肺癌与“咳嗽”、“肺痿”、“肺积”、“息责”、“肺痈”等具有共通之处。流行病学表明，吸烟是肺癌最大的危险因素之一［13］，烟毒长期熏蒸肺脏，耗伤阴液，炼津成痰，痰聚化火，进一步耗伤气阴，损伤肺络，导致痰瘀互结［14］。根据清代《医门补要》言：“表邪遏伏于肺，失于宣散，并嗜烟酒，火毒上熏，久郁热炽，烁腐肺叶”；《杂病源流犀烛·积聚癥瘕痃癖痞源流》记载：“邪积胸中，阻塞气道，气不得通，为痰，为食，为血，皆邪正相搏，邪既胜，正不得制之，遂结成形而有块。”，进一步佐证了肺癌的核心病机为痰瘀互结，火毒熏肺。而苇茎汤不仅擅长清热排脓，叶天士在运用此方时取其行气、活血、逐瘀之功［15］。基于此，苇茎汤可有效治疗NSCLC，但其作用机制尚未明确。

本研究筛选出苇茎汤的有效成分，构建有效成分与靶点的网络图发现四味中药的主要成分为β‐谷甾醇、豆甾醇、金色酰胺醇酯、阿魏酸。其中，豆甾醇为芦根、薏苡仁、冬瓜子共同成分。该4 种成分均被证实具有抗肿瘤作用，如金色酰胺醇酯、阿魏酸可显著抑制肺癌细胞A549 生长［16］。有研究发现从植物中提取的豆甾醇、β‐谷甾醇可以在不损伤正常肺组织细胞的同时，对人肺腺癌细胞A549 有着较强的抑制作用［17，18］。此外，β‐谷甾醇可以与小肠刷状缘酶竞争，降低机体对胆固醇的吸收，从而降低肺癌的发生风险［19］。Vundru 等［20］发现，β‐谷甾醇可通过下调人肺腺癌A549 细胞中CDK4、细胞周期蛋白D1 的表达水平，上调p21/Cip1 和p27/Kip1 蛋白的表达，将细胞周期阻滞于G0∕G1期，从而诱导人肺腺癌A549 细胞的凋亡。

通过String、Cytoscape3.7.2 软件MCODE 插件构建苇茎汤治疗非小细胞肺癌的蛋白互作网络，结果发现 EGFR、JUN、TNF、MAPK8、CASP3、HSP90AA1、JAK2、PTGS2 是治疗非小细胞肺癌的核心靶点。EGFR 又称表皮生长因子受体，是酪氨酸激酶受体ErbB 家族的4 个成员之一。基因突变可导致 EGFR 异常活化，从而启动 EG‐FR‐Ras‐Raf‐MEK‐ERK 和PI3K/Akt 信号通路引起肿瘤细胞的异常增殖［21］。EGFR 突变广泛见于非小细胞肺癌患者，使用针对EGFR 突变的靶向药物进行治疗也取得显著疗效［22］。相关研究表明，苇茎汤可以延长肺癌Lewis 小鼠的生存期，并下调其肿瘤组织中EGFR 的表达［23］。HSP90AA1 为热休克蛋白家族成员，该家族在恶性肿瘤细胞的增殖、分化、远处转移中发挥关键作用，且在NSCLC 患者中高度表达［24］。相关研究表明，HSP90 抑制剂17‐AAG可诱导人肺癌A549 及H446 细胞的凋亡［25］。JAK2是Janus 激酶家族的成员，可激活特定STAT（信号转导子和转录活化子），调控基因的转录［26］。JAK/STAT 信号通路被认为与非小细胞肺癌的发生、转移、耐药机制的形成密切相关［27‐29］。姜泽群等［30］通过检测Lewis 肺癌原位移植小鼠肿瘤组织lncRNA、mRNA 的水平，发现苇茎汤干预组小鼠下调的靶基因显著富集于JAK/STAT 信号通路，提示苇茎汤可能通过抑制JAK/STAT 信号通路来治疗非小细胞肺癌。

GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析的结果显示，苇茎汤治疗非小细胞肺癌的作用机制主要涉及细胞凋亡、p53、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路。细胞凋亡信号通路主要分为内源性与外源性两种，二者相对独立，又交互作用。研究证实，当发生内源性细胞凋亡时，缺血、缺氧等病理因素首先引起线粒体膜渗透性改变，并使线粒体释放凋亡相关蛋白，如线粒体细胞色素c，介导细胞进一步的凋亡［31］。外源性细胞凋亡途径多指由膜死亡受体所介导的凋亡途径。死亡配体能与相应死亡受体相结合，形成三聚体，多聚化的死亡受体的死亡结构域发生改变，从而与其他接头蛋白进行结构域同源配对结合，形成死亡诱导信号复合体，进一步诱导细胞凋亡［32］。相关研究表明，p53 是NSCLC 中突变率最高的基因之一，而p53 作为转录因子，可促进凋亡相关基因如Bax、Fas 等的表达上调，并通过这些蛋白参与线粒体介导的和死亡受体介导的凋亡途径［33］。而不论是死亡受体介导的凋亡途径所激活的caspase‐8、caspase‐10，还是线粒体介导的凋亡所激活得caspase‐9，均可水解激活caspase‐3、‐6和‐7 从而引发下游caspase 级联反应，通过灭活凋亡抑制因子、激活促凋亡因子Bid、直接降解细胞骨架相关蛋白三条途径引起肿瘤细胞凋亡［34］。苇茎汤中的多种成分可参与诱导肿瘤细胞凋亡，Rajavel等［35］发现桃仁所富含的β‐谷甾醇可以显著上调Cas‐pase 3、9 以及p53 的表达水平，可通过内、外源性凋亡途径诱导肺腺癌A549 细胞凋亡；此外吴竞等［36］使用苇茎主要成分阿魏酸干预裸鼠肺癌A549 模型，发现阿魏酸可以上调Caspase‐3 蛋白的表达，降低mTOR 的水平，激活细胞凋亡与自噬进程，抑制肿瘤细胞生存。

肿瘤新生血管活跃在NSCLC 的发展中发挥着关键作用，VEGF 可在缺氧诱导因子（HIF‐α）等的活化作用下，与VEGFR 结合，激活PI3K‐AKT、MAPK 信号通路促进肿瘤血管的增殖［37］。目前，VEGF‐A 抑制剂贝伐珠单抗已被FDA 列为NSCLC 非鳞状细胞癌在无驱动基因突变的一线用药。周珊珊等［38］通过细胞实验证实，同样富含β‐谷甾醇的大黄可以降低肾小管上皮细胞中VEGF 蛋白的表达水平。除此以外，VEGF 还参与了肿瘤免疫抑制微环境的形成，促使肿瘤发生免疫逃逸［39］。相关研究表明，Treg 细胞是一类具有免疫抑制功能的T 细胞亚群，VEGF 对Treg 具有趋化作用，在小鼠黑色素瘤模型中发现，NRP1 在Foxp3+Treg 中高表达，肿瘤细胞自分泌的VEGF 作为趋化因子，可以引导Treg 浸润肿瘤组织，从而负向调控抗肿瘤免疫效应［40］。而一项临床试验表明，苇茎汤可以明显降低重症肺炎患者CD4+CD25+Treg 细胞数目，差异较对照组有统计学意义（P<0.05）［41］。因此，笔者预测苇茎汤可能通过减少Treg 细胞的数目来改善NSCLC 免疫抑制微环境。

综上所述，苇茎汤可能作用于Caspase‐3、Caspase‐8、Caspase‐9、p53、VEGF 等关键靶点，通过调节细胞凋亡通路、p53 信号通路、VEGF 通路以及下调Treg 细胞表达来治疗NSCLC。本研究仍存在一些局限，如药物成分与靶点之间的作用、苇茎汤对免疫微环境的调节，尚需进一步实验证明。