基于网络药理学探讨夏枯草对Graves 病的作用机制

李 俊，魏军平

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院广安门医院，北京 100053）

甲状腺功能亢进症是由于甲状腺激素分泌过多而引起的循环、神经、消化系统等兴奋性增高和代谢亢进为主要特征的临床综合征，其中80%是由Graves 病（Graves' disease, GD）引起的。甲亢流行病学因诊断阈值、测定方法及碘营养状况的差异而不同[1]。欧洲的一项荟萃分析表明患病率约为0.8%，美国调查显示为1.3%，而我国的患病率约为0.8%[2,3]。GD 是常见的器官特异性自身免疫疾病之一，甲状腺刺激性抗体是其特征性致病抗体，存在于90%以上的病人。除自身免疫因素以外，碘营养状况、心理压力、性别、吸烟、硒、免疫调节剂等也可能导致疾病的发展[4‐6]。甲亢的主要治疗方法是抗甲状腺药物、放射性碘和手术，在美国以外地区首选ATD 作为主要治疗方法，但对于持续性或复发性甲亢患者，应使用手术和放射性碘。抗甲状腺药物可抑制甲状腺激素的合成，但缓解率较低、容易复发。放射性碘和手术见效快，但甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退、喉返神经损伤等副作用常见，故临床应用受限。中药治疗GD 具有特殊优势，在调节机体免疫的同时可以可减少抗甲状腺药物所致肝功能异常等毒、副作用，降低复发率和甲减发生率[7]。夏枯草(Prunella vulgaris)味辛、性苦寒，归肝胆经，功能清热泻火、明目、散结消肿等，常用以治疗瘰疬、痈肿、眩晕头痛等。药理研究表明其具有降压、降糖、抗菌消炎、免疫抑制、清除自由基及抗氧化、抗肿瘤、抑制病毒生长等多种作用[8]。不少临床研究表明夏枯草制剂与西医治疗相结合可有效降低抗体水平、调节异常免疫功能并改善甲状腺功能，但其临床作用机制尚未完全明确[9，10]。网络药理学是基于系统生物学理论，通过网络的构建及分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科[11]。本研究通过网络药理学的方法，收集夏枯草的治疗GD 的有效成分、探究其治疗GD 的作用靶点及机制，为夏枯草治疗GD 的临床研究提供新的理论依据。

1 材料与方法

中草药系统药理学平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）；DisGeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/）；GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）；STRING 数据库（https：//string‐db.org/）；PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）；DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.6.1软件；PyMOL 2.3.2软件；AutoDock‐Tools 1.5.6软件；AutoDock Vina 1.1.2软件。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草活性成分及靶点筛选 从TCMSP 平台通过检索并获取夏枯草的相关化学成分［12］。根据ADME 特性对所获取的化学成分进行筛选，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（druglikeness，DL）≥0.18 为条件，筛选出符合条件的化学成分［13，14］。同时应用TCMSP 获取相关成分的靶点，并通过Uniprot 数据库将相关靶点蛋白转换为标准基因。

1.2.2 Graves 病相关靶点获取 同时检索Gene‐Cards 数据库及DisGeNET 数据库数据库，获取GD相关的疾病靶点。将两个数据库中所得靶点结果合并去重，并将最终所得靶点名标准化。将夏枯草作用靶点与GD 疾病靶点二者取交集，得到夏枯草治疗的GD 的关键靶点。

1.2.3 构建“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络 使用Cy‐toscape 软件构建“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络。以药物、药物活性成分、疾病、疾病靶点为节点，通过Excel 表格构建相应关系。然后将表格导入Cyto‐scape 软件中绘制“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络图，观察夏枯草活性成分与疾病靶点之间的相互作用，确定网络中的关键成分和关键靶点［12］。

1.2.4 构建关键靶点的蛋白互作网络 将夏枯草治疗GD 的关键靶点数据导入STRING 数据库，构建夏枯草治疗GD 的蛋白‐蛋白互作网络（protein protein interaction network，PPI network），分析关键靶点蛋白之间的作用关系。PPI 网络中，各个节点的大小和颜色深浅反映其自由度（Degree）值的大小，其中Degree 值越大代表此节点在网络中越重要。

1.2.5 GO 生物功能注释和KEGG 通路分析 将得到的夏枯草治疗GD 的关键靶点导入DAVID 数据库进行GO（gene ontology）生物学过程和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。以阈值P<0.05 为条件筛选排名靠前的生物学过程或通路，并使用R 语言绘图使结果可视化。

1.2.6 分子对接验证 从“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络中选取关键活性成分和PPI 网络中的核心靶蛋白，在TCMSP 数据库和PDB 数据库分别下载成分及靶蛋白的结构文件。利用PyMol 软件将靶蛋白的配体分离并去除水分子，然后将小分子成分和靶蛋白受体使用AutoDockTools 软件处理并保存为相应格式文件。最后利用AutoDock Vina 软件进行对接验证，评价夏枯草关键活性成分与核心靶蛋白之间的对接情况。

2 结果

2.1 夏枯草化学成分及作用靶点

从TCMSP 数据库中共检索到的夏枯草的化学成分有60 个，依据ADME 特性对成分进行筛选（OB≥30%，DL≥0.18），符合条件的化学成分有11 个［13］，删除无靶点信息的化学成分，最终获取10个活性成分。见表1。在TCMSP 数据库中查询符合筛选条件的活性成分的作用靶点并去重，结果显示有10 个成分一共作用于198 个靶点，最后使用Uniprot 数据库将这些靶点蛋白转换为对应基因。

表1 夏枯草化学成分筛选Tab 1 Selected active constituents of Prunella vulgaris from TCMSP

2.2 夏枯草治疗GD 的靶基因筛选

同时使用GeneCards 及DisGeNET 数据库检索GD 的疾病基因。从GeneCards 数据库中筛选得到靶基因1 467 个，将Relevance score≥20 的155 个纳入研究。从DisGeNET 数据库中筛选得到585 个靶基因，将两个数据库中检索到的靶基因合并去重后共得到靶基因646 个。比对夏枯草作用靶点基因与GD 疾病靶基因，共筛选出二者的交集靶基因57 个并用于后续分析，见图1。

图1 夏枯草化学成分作用靶点与Graves病疾病靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of the targets of Prunella vulgaris chemical components and the disease targets of Graves disease

2.3 “药物‐成分‐疾病‐靶点”网络的构建

为了深入探究夏枯草的活性成分、作用靶点与疾病靶点之间的关系。通过Cytoscape 软件构建“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络，见图2。网络中共有节点67 个，其中8 个节点代表活性成分，57 个节点代表疾病靶点，节点相互作用关系172 条。其中椭圆形代表GD，圆形代表GD 的靶基因，棱形代表夏枯草及其活性成分，节点之间的连线代表二者之间的相互作用。相连的节点数目越多，那么图形的面积越大，颜色越深（橙色>浅黄色>浅绿色>浅蓝色），意味着这个靶点或化合物越在这个网络中的作用就越关键。以degree 值为筛选条件，得到槲皮素、木犀草素、山柰酚这3 个成分可能是夏枯草治疗GD 的关键成分，见表2。

图2 夏枯草治疗Graves 病“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络图Fig 2 "drug-component-disease-target" network diagram of the treatment of Gravse with Prunella vulgans

表2 夏枯草治疗GD 的关键成分Tab 2 The key active components of Prunella vulgaris in treating GD

2.4 PPI 网络的构建与分析

将上述的57 个关键靶点的数据导入STRING数据库，从数据库中导出相应数据并通过Cytoscape软件中构建PPI 网络图，见图3。该网络共涉及57个靶点及688 条作用关系。图中各节点随着degree值由小到大，则节点面积逐渐增大、颜色逐渐加深，且节点越接近圆心。筛选出degree 值靠前的10 个靶点，预测这些靶蛋白可能是夏枯草治疗GD 的核心靶点见表3。

图3 夏枯草治疗Graves 病PPI 网络图Fig 3 PPI network diagram of Prunella vulgaris treatment of Graves disease

表3 夏枯草治疗GD 的核心靶点Tab 3 The key targets of Prunella vulgaris in treating GD

2.5 GO 生物功能注释和KEGG 通路分析

为了进一步探究夏枯草治疗GD 的作用机制，对57 个关键靶点进行GO 生物功能注释和KEGG信号通路分析［15］。GO 富集分析分为生物学过程、细胞组分及分子功能。从结果来看，夏枯草治疗GD 的关键靶点主要涉及的生物过程有：一氧化氮生物合成过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、炎症应答（inflammatory response）、对乙醇的反应（response to ethanol）、衰老（aging）、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（posi‐tive regulation of transcription from RNA poly‐merase Ⅱpromoter）、凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）、药物反应（response to drug）、基因表达的正调控（positive regulation of gene expression）；主要存在于细胞外间隙（extracel‐lular space）、胞外区（extracellular region）、质膜外侧（external side of plasma membrane）、线粒体（mito‐chondrion）等；主要参与细胞因子活性（cytokine ac‐tivity）、酶结合（enzyme binding）、同一蛋白结合（identical protein binding）等，见图4。KEGG 通路分析结果表明夏枯草治疗GD 的关键靶点涉及了TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、HIF‐1 信号通路（HIF‐1 signaling pathway）、癌症相关通路（pathways in cancer） 、PI3K‐Akt 信 号 通 路（PI3K‐Akt signaling pathway）、细胞因子‐细胞因子‐受体相互作用（cytokine‐cytokine receptor interac‐tion）、癌症蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）等，见图5。提示夏枯草可能通过调控上述信号通路发挥治疗GD 的作用。

图4 GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

图5 KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis

2.6 分子对接

选择“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络中的关键活性成分槲皮素与PPI 网络中3 个核心靶蛋白进行分子对接。在PDB 数据库下载AKT1、IL‐6 及TNF的蛋白结构文件，采用Pymol 软件去掉水分子和配体分子。再用AutoDockTools 软件进行格式转化并使用AutoDock Vina 软件进行分子对接［16］，其中Full fitness 值越低，说明靶蛋白与小分子的结合越紧密，见表4。结果显示，槲皮素与3 个靶蛋白均可对接，且槲皮素与AKT1 的对接效果最好（图6），其次是槲皮素与IL‐6 的对接（图7），最后是槲皮素与TNF 的对接结果（图8）。故预测夏枯草中的槲皮素与疾病靶点AKT1 的相互作用在夏枯草治疗GD 中发挥着重要作用。

图6 槲皮素与AKT1 分子对接Fig 6 Molecular docking of quercetin and AKT1

图7 槲皮素与IL‐6 分子对接Fig 7 Molecular docking of quercetin and IL-6

图8 槲皮素与TNF 分子对接Fig 8 The docking of quercetin and TNF molecule

表4 分子对接结果Tab 4 Molecular docking results

3 讨论

从“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络图可知槲皮素、木犀草素、山柰酚等化学成分是整个网络中的重要节点。槲皮素作为一种常见的黄酮类化合物，已证实是一种抗甲状腺激素功能的物质，对甲亢和甲状腺毒性作用有改善效果。在槲皮素抑制FRTL‐5 细胞的生长的实验中，发现槲皮素可下调与甲状腺合成相关的部分基因的表达，包括NIS、TSHR、TPO和TG等，动物实验也表明槲皮素能够抑制SD 大鼠体内碘的摄取［17］。槲皮素能够有效改善甲亢诱导的甲状腺功能变化及肝脏脂质过氧化，提高SOD 和CAT 活性，并恢复肝脏D1 活性［18］。另一方面研究证实山奈酚、槲皮素等均能显著增加D2 活性，上调D2 基因的表达并使局部T3 的生成增加，提高骨骼肌细胞氧气及能量消耗［19］。木犀草素具有广泛的抗炎作用，但尚缺乏木犀草素治疗GD 的实验研究。此外，“药物‐成分‐疾病‐靶点”网络分析显示，GD 的靶基因PPARG、PIK3CG、CASP9、AKT1、TNF、ICAM1、BCL2、BAX等与夏枯草活性成分相互作用较多，提示这些靶点是夏枯草治疗GD 的潜在靶基因。GD 眼病（Graves' ophthalmopathy，GO）中眼眶成纤维细胞向脂肪细胞的分化是过氧化物酶体增殖物激活受体G 依赖性过程，其对于GO 致病组织重塑至关重要［20］。细胞间黏附分子1（ICAM1）是是淋巴细胞功能相关抗原1（LFA1）分子的配体，在炎症和免疫介导中具有重要作用。有研究发现高水平血清ICAM1 与自身免疫性甲状腺疾病有关，且抗甲状腺素过氧化物酶阳性的GD 患者的血清循环ICAM1 浓度明显高于阴性的患者［21］。GD 患者甲状腺滤泡周围的毛细血管内皮细胞和具有单核细胞聚集病变的毛细血管内皮细胞中的ICAM1 表达增强，LFA1/ICAM1 通路可能是导致单核细胞迁移到GD 患者甲状腺的原因［22］。细胞凋亡在多细胞生物的发育和内环境稳定中起重要作用，细胞凋亡与Graves 病甲状腺实质的重塑有关，并与细胞增殖密切相关，凋亡的开始与细胞内聚力的丧失和Bcl‐2表达的下降有关［23］。原癌基因Bcl-2与Bax 对细胞凋亡起着重要的调节作用，其中Bcl-2是对细胞凋亡有明显抑制作用。过度表达的Bcl‐2 不仅能抑制甲状腺细胞凋亡，同时可减少淋巴细胞对甲状腺细胞的破坏［24］。Casp9 是细胞凋亡蛋白酶活化因子成员之一，通过与Bcl‐2 家族等蛋白因子的相互作用来调控细胞凋亡的进程［25］。因此，对细胞凋亡过程的调节在夏枯草治疗GD 中可能发挥着重要作用。

从PPI 网络结果可知：AKT1、IL‐6、TNF、VEGFA、TP53、IL‐10、CXCL8 等是夏枯草治疗GD的核心靶点。其中，IL‐6、TNF、TP53 等的遗传变异与GD 发生风险之间存在显着关联，也显示了炎症相关基因的多态性与GD 的发病机制的密切关系［26，27］。CD40 是一种肿瘤坏死因子受体，是GD 以及多种自身免疫性疾病的免疫调节敏感性基因。甲状腺CD40 过表达会增加甲状腺特异性抗体的产生，CD40 通过激活下游细胞因子和趋化因子来介导这种作用，主要包括IL‐6、IL‐8、TNF‐α 等［28］。GD以甲状腺实质的淋巴细胞浸润为特征，在甲状腺组织中，辅助Th1 淋巴细胞可能增强TNF‐α 的产生，CXCL8 分泌随TNF‐α 浓度的增加而呈剂量依赖性增加。这些因子间会建立一个放大的反馈回路，从而启动并延续自身免疫过程，CXCL8 可能与疾病的后期慢性持续阶段有关［29］。IL‐6 是参与B 细胞活化和调节脂肪细胞代谢的细胞因子，IL‐6 可能通过增加眼眶脂肪/结缔组织内自身抗原的表达而在GO的发病中起重要作用［30］。此外，活动性GO 的甲状腺毒性患者的血清VEGF 升高可能反映了眼眶和甲状腺组织中长期存在的自身免疫过程以及甲状腺中血管生成的增强，也反映了眼部炎症活动的程度［31］。这些核心蛋白广泛参与了GD 发病中的免疫及炎症过程，尤其在GO 的发病中显得更为重要。

从GO 富集分析结果可知，夏枯草主要影响GD的炎症应答、凋亡过程的负调控等相关生物学过程等。在Graves 病的初期以Th1 细胞介导的炎症反应为主，而疾病后期主要是Th2 细胞介导的免疫炎症反应。因此炎症应答过程的调节在GD 的各个时期都是有效的。正常甲状腺细胞分裂不活跃，细胞凋亡保持在一个较低水平，这种低水平有利于维持腺体的大小和功能的稳定［32］。而GD 发生时甲状腺细胞增生活跃并伴有细胞凋亡水平的增加。对于凋亡过程的负调控可能有利于减少毒性淋巴细胞对甲状腺细胞的破坏作用。KEGG 富集分析结果表明，夏枯草治疗GD 的关键靶点涉及包括TNF 信号通路、HIF‐1 信号通路、PI3K‐Akt 信号通路及癌症相关通路。TNF 通路、PI3K‐Akt 通路主要是对炎症反应及细胞凋亡相关过程的调控。此外，这些通路与GO 关系密切，甲状腺相关眼病中TSHR 信号直接通过PI3K‐Akt 信号刺激增殖［33］。缺氧也可通过激活眼眶成纤维细胞中的HIF‐1 依赖性途径来刺激血管生成和脂肪生成，从而影响GO 的组织重塑［34］。GD 与甲状腺癌发生率之间的关系仍存在较大争议，癌症相关通路在疾病中的作用尚需进一步研究。

综上所述，本研究基于网络药理学对夏枯草治疗GD 的主要活性成分、关键作用靶点及重要信号通路进行了探讨，并通过分子对接对部分成分和靶点进行了验证。结果表明，夏枯草的多种活性成分可通过炎症及细胞凋亡等相关过程参与GD 的治疗，更值得注意的是这些靶点在GO 中表现得更为重要，也为进一步研究其相关机制奠定了基础。