核桃低聚肽对吲哚美辛致大鼠胃溃疡的作用研究

刘睿，郝云涛，刘欣然，珠娜，康家伟，毛瑞雪，胡佳妮，于晓晨，李臻，李勇

（北京大学医学部公共卫生学院，北京 100191）

非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是一类具有解热、镇痛、消炎和降低血小板黏附力的药物，被广泛用于疼痛、发热、类风湿、软组织损伤等疾病的治疗[1]。 研究发现NSAIDs 对胃肠道、肝脏、神经、泌尿、血液和心血管系统等都会产生诸多药物不良反应， 尤其以胃肠道反应最为明显，可引起胃黏膜糜烂、溃疡、出血和穿孔等[2-3]。 据统计，约有25%的长期服用者会并发胃溃疡，一般年发病率为2%～4%。 随着NSAIDs 应用范围和用量的不断增加，NSAIDs 相关性胃肠病的发病率随之上升。根据其致病机制， 目前已有多种方法防治NSAIDs 导致的胃黏膜损伤，然而各种方法均有其局限性及副作用[4]。 因此，从营养治疗的角度出发，积极寻找安全、有效的能改善胃黏膜损伤异常状态的功效成分，具有重要的科学意义和实际应用价值。

核桃低聚肽（walnut oligopeptides，WOPs）是利用生物酶解技术从核桃蛋白中提取的小分子生物活性肽，目前研究已证实WOPs 具有提高记忆力[5]、抗辐射[6]、润肠通便[7]、抗疲劳[8]等多种生理活性，但尚无针对NSAIDs相关胃溃疡的研究报道。 因此，本研究通过建立吲哚美辛诱发的大鼠胃溃疡模型，设立乳清蛋白和奥美拉唑作为阳性对照组， 来探讨WOPs 对NSAIDs 相关胃黏膜损伤的保护作用及其可能机制。 此外，前期研究在小鼠背部皮肤切口手术模型中发现牛骨胶原低聚肽（bovine collagen oligopeptides，BCOPs）具有一定的促进皮肤伤口愈合的作用[9-10]。 因此，特设了BCOPs 与WOPs 的配伍剂量组， 探讨其配伍后对胃黏膜损伤的联合保护效应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃低聚肽（淡黄色固体粉末，经高效液相色谱法分析发现，分子量小于1 000 Da 的低聚肽占86.5%）、牛骨胶原低聚肽（肽含量为92.77 g/100 g）：吉林肽谷生物工程有限责任公司；吲哚美辛：Sigma-Aldrich 公司；奥美拉唑肠溶片（批准文号：国药准字H19990114）：北京太洋药业股份有限公司；乳清蛋白（蛋白含量为78%）：北京中柏公司；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）检测试剂盒：联科生物技术股份有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

AdventurerTM 通用型分析天平： 美国OHAUS 公司；LXJ-IIC 大容量低速离心机：德国Eppendorf 公司；Nihon Kohden Celltac 2 全自动血球计数仪： 日本光电工业株式会社；FSH-2A 可调高速电动匀浆机：金坛市金南仪器厂；GNP-9080 型隔水式恒温培养箱：上海创奕科教设备有限公司；FLUOstar Omega 多功能酶标仪：德国BMG LABTECH 公司。

1.3 动物分组及干预

实验采用雄性SD 大鼠80 只，体重（200±20）g ，购自北京大学医学部实验动物中心。 实验大鼠饲养在北京大学医学部实验动物科学部大鼠实验室。 此外，在前期的研究中发现WOPs 440 mg/kg bw 剂量组表现出较好的提高记忆力[5]、抗辐射[6]、抗疲劳[8]的效果。 因此，本研究以440 mg/kg bw 为中间剂量，设置了低、中、高3 个WOPs 剂量组， 以进一步探索WOPs 的最佳干预剂量。 因此，适应性喂养1 周后，将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、乳清蛋白组（440 mg/kg bw）、奥美拉唑组（20 mg/kg bw）、WOPs 干预组（220、440、880 mg/kg bw）和配伍组（WOPs 440 mg/kg bw+ BCOPs 1.5 g/kg bw），每组10 只。干预溶液均用蒸馏水配制，每日经口灌胃干预，正常对照组和模型对照组给予蒸馏水，其余组给予相应浓度受试物，灌胃30 d。

1.4 方法

1.4.1 胃溃疡造模

干预30 d 后，禁食24 h（不禁水）后，给予吲哚美辛溶液（溶于1%吐温80，剂量为48 mg/kg bw）腹腔注射，正常对照组给予等量1%吐温80 腹腔注射，4 h 后乙醚麻醉处死动物，进行相关指标的检测[11-12]。

1.4.2 胃黏膜损伤评分

快速取出胃组织，沿着胃大弯剪开，冰冻生理盐水洗净胃内容物，以损伤发生率、损伤积分指数和损伤抑制率来表示各组大鼠胃黏膜损伤程度。

损伤积分指数：用游标卡尺测量出血点或出血带的长度和宽度，长度＜1 mm（包括糜烂点）为1 分，1 mm～2 mm为2 分，2 mm～3 mm 为3 分，3 mm～4 mm 为4 分，长度＞4 mm 分段测量；宽度＞2 mm 者，分数乘以2；分数之和为损伤总积分[13-14]。

式中：A、B 分别为模型组与试验组的损伤积分。

1.4.3 血常规检测

取全血40 μL，加入稀释液中，用全自动血球计数仪测定大鼠血常规指标。

1.4.4 胃组织PGE2、NO、MPO 指标的测定

准确称取胃组织，按照1 ∶9（g/mL）的比例加入匀浆介质，剪碎组织，冰水浴制备匀浆，3 000 r/min，离心10 min，取上清液贮藏于-20 ℃冰箱中，根据试剂盒说明书对胃组织PGE2、NO、MPO 的水平进行检测。

1.5 数据处理

使用SPSS 24.0 软件对数据进行分析。 连续变量数据用均数±标准差表示， 行单因素方差分析并采用最小显著性差异法进行组间的统计检验。 P＜0.05 具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 一般情况

WOPs 对大鼠初始体重和终末体重的影响见图1。

图1 WOPs 对大鼠初始体重和终末体重的影响Fig.1 Effects of WOPs on initial body weight and final body weight of rats

如图1 所示，在30 d 的实验周期内，各实验组大鼠外观体征和行为活动、粪便性状、食量等均未见异常，无中毒体征及死亡。 WOPs 灌胃干预30 d 后，各实验组间初始体重、终末体重未见明显差异（P＞0.05）。

2.2 WOPs 对大鼠胃溃疡积分指数的影响

WOPs 对大鼠胃溃疡积分指数的影响见表1。

表1 WOPs 对吲哚美辛诱发大鼠胃溃疡积分指数的影响Table 1 Effect of WOPs on gastric ulcer index in indomethacintreated rats

如表1 所示，与模型对照组相比，3 个WOPs 干预组及配伍组损伤积分指数显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与乳清蛋白组相比，WOPs（220mg/kgbw）、WOPs（880 mg/kg bw）组和配伍组损伤积分指数降低，损伤抑制率升高，但未观察到统计学差异（P＞0.05）。奥美拉唑组损伤积分指数最低，损伤发生率仅为40%，损伤抑制率则达到了78.65%，且与WOPs（220 mg/kg bw）、WOPs（440mg/kgbw）和乳清蛋白组相比，差异具有显著性（P＜0.05）。

2.3 WOPs 对大鼠血液学指标的影响

2.3.1 WOPs 对大鼠白细胞和血小板的影响

WOPs 对大鼠白细胞和血小板的影响见表2。

表2 WOPs 对大鼠白细胞的影响Table 2 The effect of WOPs on white blood cell of rats

如表2 所示，与正常对照组相比，模型对照组白细胞（white blood cell，WBC）数量、单核细胞（monocyte，MOD） 数量、 单核细胞百分数、 嗜中性粒细胞（neutrophilic granulocyte，GRN） 数量和嗜中性粒细胞百分数显著升高（P＜0.05）。 与模型对照组相比，WOPs 各剂量组淋巴细胞（lymphocyte，LYM）百分数嗜中性粒细胞百分数显著升高。与奥美拉唑组相比，WOPs 各剂量组及配伍组单核细胞百分数均显著下降（P＜0.05），WOPs 高剂量组GRN 数量显著下降（P＜0.05）。

2.3.2 WOPs 对大鼠红细胞血小板和血红蛋白的影响WOPs 对大鼠红细胞、 血红蛋白和血小板的影响见表3。

表3 WOPs 对大鼠红细胞、血红蛋白和血小板的影响Table 3 The effect of WOPs on red blood cell，hemoglobin and platelet of rats

如表3 所示，与正常对照组相比，模型对照组血小板（platelet，PLT）水平明显下降（P＜0.05）。 与模型对照组相比，WOPs 改善了血小板的异常变化，WOPs（880 mg/kg bw） 组红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）明显降低（P＜0.05）。 红细胞（red blood cell，RBC）、血红蛋白（hemoglobin，HGB）和平均红细胞血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）在各组间无明显差异（P＞0.05）。

2.4 WOPs 对大鼠胃组织PGE2、MPO、NO 水平的影响

WOPs 对大鼠胃组织PGE2、MPO、NO 水平的影响见表4。

表4 WOPs 对大鼠胃组织PGE2、MPO 和NO 水平的影响Table 4 Effects of WOPs on gastric PGE2，MPO and NO levels of rats

如表4 所示， 与正常对照组相比， 模型对照组MPO、NO 水平明显增加，PGE2 水平降低（P＜0.05）。 与模型对照组相比，WOPs 各剂量组和配伍组的MPO 水平均显著下降。 与奥美拉唑组相比，WOPs 中、高剂量组和配伍组MPO 水平均明显升高（P＜0.05）。

3 讨论

NSAIDs 多呈弱酸性，脂溶性高，可穿过胃黏膜表面进入胃黏膜细胞并停留聚集在细胞内，产生直接细胞毒效应，破坏上皮细胞层的完整性。 此外，局部刺激性NSAIDs 可降低胃黏膜屏障的疏水性， 削弱胃黏膜屏障作用，使胃黏膜更易受到损伤[15]。吲哚美辛是研究NSAIDs 相关胃溃疡的最常用药。本研究对经吲哚美辛处理大鼠的胃黏膜观察发现，WOPs 可减轻吲哚美辛对大鼠胃黏膜的直接损伤程度，且高剂量组损伤程度明显轻于乳清蛋白组，但在奥美拉唑组胃黏膜损伤程度最轻，损伤发生率仅为40%，损伤抑制率高于其它各组。 血常规是最基本的实验室检查指标之一，根据血液细胞形态分布及数量的变化，可及早发现病情或对疾病做出初步诊断。在本研究中，WOPs 对大鼠白细胞和血小板水平的异常变化具有一定改善作用，且WOPs 对单核细胞百分数和嗜中性粒细胞的抑制作用强于奥美拉唑组，提示WOPs 具有较好的抗炎效果。

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）在体内的代谢途径主要有两种：一种是在环氧合酶催化作用下合成前列腺素（prostaglandins，PGs）、前列环素及血栓素；另一种在脂加氧酶的作用下生成白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、白三烯C4（leukotriene C4，LTC4）、白三烯D4（leukotriene D4，LTD4）等[16]。 NSAIDs 会导致花生四烯酸第一种代谢途径被抑制， 造成PGs 合成减少。PGE2 是人体胃肠道最重要含量也最高的PGs，不仅能够维持胃黏膜的完整性，还可以有效拮抗各种侵袭因子对胃黏膜的损伤[17]。本研究发现，吲哚美辛（48 mg/kg）腹腔注射造模后，模型对照组、乳清蛋白组、奥美拉唑组大鼠胃组织PGE2 活性明显低于正常对照组（P＜0.05），WOPs（440 mg/kg bw）和WOPs（880 mg/kg bw）组PGE2 活性则明显高于模型对照组、 乳清蛋白组和奥美拉唑组（P＜0.05），提示WOPs 可通过提高PGE2 活性的方式保护胃黏膜免受有害因素的刺激损伤，且WOPs 中、 高剂量对PGE2 合成的促进作用强于乳清蛋白和奥美拉唑组。

一氧化氮是胃黏膜正常生理功能的基本调控介质，常是各种胃黏膜病变的关键环节。 生理条件下，结构型一氧化氮合酶（construtive nitric oxide synthase，cNOS）反应持续产生极少量的NO，具有改善胃黏膜血流量，促进胃黏液的分泌等保护胃黏膜的作用[18]。但当机体处于病理状态时，诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 在炎症等刺激因素的诱导下会产生大量NO，造成血管微循环障碍，引起炎症反应[19-20]。 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性常被用来评估组织中的中性粒细胞的聚集浸润程度[21]。NSAIDs 摄入会激活花生四烯酸第二种代谢途径，造成LTB4、LTC4、LTD4 等的大量生成， 趋化中性粒细胞聚集脱粒，导致氧自由基的大量产生。 当氧自由基在体内堆积不能被及时清除时，会直接损害胃黏膜血管内皮细胞， 且中性粒细胞易黏附在血管内皮造成微血栓，引起胃黏膜损伤。 本研究发现，WOPs 干预明显抑制了大鼠胃组织MPO 水平的升高， 且配伍组MPO 水平低于奥美拉唑组（P＜0.05），表明WOPs 可以通过抑制中性粒细胞聚集浸润及iNOS 介导的NO 的过度产生，从而发挥对胃黏膜保护作用，且配伍组对MPO 的抑制作用强于奥美拉唑组。

4 结论

综上，WOPs 可以减轻NSAIDs 对胃黏膜的直接损伤程度，促进胃黏膜保护因子PGE2 的合成，并抑制中性粒细胞的聚集浸润和NO 含量的异常增高， 从而对吲哚美辛诱发的胃溃疡发挥较好的保护作用，其作用机制可能与改善机体营养状况、 减轻NSAIDs 对前列腺素介导途径的抑制作用及NSAIDs 引起的机体炎症反应和氧化损伤有关。此外，本研究发现WOPs 的作用效果呈现出一定的剂量依赖性， 在WOPs 高剂量组（880 mg/kg bw） 表现出较好的胃黏膜保护效果，但配伍组与WOPs 干预组的整体效果差异并不显著。 后续研究还需在现有基础上，继续优化剂量设置，并在体外研究和人群研究进一步证实其生理作用及适宜剂量， 以期为WOPs 在人群中的应用提供更多的科研依据。