实时荧光PCR在虹鳟源性成分鉴别中的应用

刘金玉，季超，靳佳瑞，张芹，郝韫，解玉鑫，冯宇赜，李娟，伍志强，汪星宇，郑文杰*

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.云南农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201）

虹鳟肌肉中蛋白含量、脂肪含量以及必需氨基酸含量均高于青鱼、草鱼、鲢鱼等几种常见的淡水鱼[1-2]，其骨中蛋白质和脂肪含量分别为20.69%和22.8%，不饱和脂肪酸含量为83.54%，均高于一般鱼类[3]，所以虹鳟的需求量及产量都与日俱增；根据联合国粮农组织渔业统计数据， 从2008 年到2018 年全球虹鳟产量已从67.732 万吨增长到84.919 6 万吨； 就我国而言，2017 年我国冷水鱼产量在5 万吨左右， 其中虹鳟约占3.860 6 万吨[4]。作为美味又富有营养的食品而言，虹鳟食用方法很多，主要的商品有生鱼片、罐头、鱼糜、烟熏制品等，虹鳟鱼皮还可以用作胶原蛋白的提取[5]。由于部分商品在加工过程中形态学特征受到不同程度的破坏，通过商品形态无法对其是否源自虹鳟进行判别[6]，所以常用核酸与蛋白质等方法对其真实性加以鉴别。 因蛋白质具有组织特异性且在食品加工过程中的高温、 高压以及高盐处理可能会使其发生变性，检测的准确性会受到影响[7]。 因此，基于核酸的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法成为目前用于水产品鉴别的主要方法。

实时荧光聚合酶链式反应（real-time fluorescence PCR，RT-PCR）检测在食品及鱼类产品中应用已较为广泛。 李秋阳等[8]对荧光定量PCR 检测在食品中的应用做了相应的介绍，方军等[9]利用实时荧光PCR 建立了对鱼翅这种加工要求较高的产品的检测方法，方法较为稳定可行；郭凤柳等[10]也开发了针对掺假肉类的PCR 检测方法；ZHAO 等[11]进行了以PCR-测流免疫分析法鉴定驴肉源性的研究；史莹莹等[12]建立了实时荧光定量PCR 鉴定肉制品中牛源性成分及其含量方法；罗建兴等[13]利用实时荧光定量PCR 法检测对食品中鹌鹑源性成分进行检测；汪艺等[14]对水产品中的鳕鱼建立了实时荧光定量聚合酶链式反应能快速鉴定3 种鳕鱼。 李进波等[15]用实时荧光PCR 法鉴定食品中鲑亚科鱼成分，并可用于市场上鲑科鱼及产品的检测。

本研究以虹鳟为研究对象，利用线粒体基因具有编码效率高、在不同区域进化速度存在差异和母性遗传等特点[16-17]，针对虹鳟较其它鱼类在线粒体基因组上保守度相对较高的ATP6 设计特异性引物和探针[18-19]，建立针对虹鳟源性成分的实时荧光PCR 检测技术，可用于检测市售的三文鱼产品是否含有虹鳟源性成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

待检测样品： 市售的三文鱼片4 份和网购的虹鳟鱼籽、烟熏、烤制及虹鳟生鱼片等18 份，详见表1。

表1 待检测样品列表Table 1 List of samples to be tested

10 份虹鳟鱼样品： 青海民泽龙羊峡公司提供；带鱼、大黄鱼、中国芦花、尼罗罗非鱼、草鱼、鲅鱼、大眼鳜、鲫鱼、石斑、蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼、长鳍金枪鱼、锦鲤、大西洋鲑、多宝鱼、鲳鱼17 种非靶标鱼样品：市售。

动物组织基因组提取试剂盒：天根生化科技有限公司；引物和探针：由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 仪器与设备

LightCyclerR480 II 实时荧光定量PCR： 美国Roche 公司；3K15 台式高速冷冻离心机： 曦玛离心机（扬州）有限公司；HH-S3 数显恒温水浴锅：金坛市金南仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

取0.1 g 样品，加入600 μL 去离子水，在5 000 r/min条件下匀浆40 s。

1.3.2 DNA 的提取

将分别匀浆后的样品，在6 000 r/min 条件下离心1 min，弃上清液留沉淀，使用动物组织基因组提取试剂盒进行样品DNA 的提取，作为PCR 扩增的模板。

特异性试验样品准备：用青海民泽龙羊峡公司提供的10 份虹鳟鱼样品和本研究中收集的其它17 个非靶标鱼类组织提取的DNA 来研究该方法的特异性。选取不同虹鳟鱼的DNA 样品10 份，经DNA 条形码技术验证后的带鱼、大黄鱼、中国芦花、秋刀鱼、尼罗罗非鱼、草鱼、鲅鱼、大眼鳜、石斑、蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼、长鳍金枪鱼、比目鱼、鲤鱼、大西洋鲑鱼、鲫鱼DNA 样品各1 份备用。

DNA 灵敏度试验样品准备：选取青海民泽龙羊峡公司提供的虹鳟鱼样品的DNA，原始浓度为50 ng/μL，用去离子水分别稀释为10、1、0.1、0.01、0.001ng/μL 备用，其中50、10、1、0.1 ng/μL 每个浓度做4 次重复试验；0.01、0.001 ng/μL 做8 次重复试验验证。

1.3.3 引物设计和选择

从NCBI 数据库中下载虹鳟、 大西洋鲑、 大马哈鱼、帝鲑、石斑、带鱼等25 种线粒体基因组全序列，利用Geneious Prime 2019 版对序列进行比对分析， 比对结果表明ATP6 基因在虹鳟中具有一定的保守性，利用软件Primer Premier 5.0 设计引物。 引物和探针序列如表2 所示。

表2 虹鳟引物及探针Table 2 Primers and probes for Oncorhynchus mykis

利用DNA 条形码技术对样品进行验证[20-22]，对收到样品进行针对线粒体COX I 基因的部分特异区段的通用（＞99%）引物FISH F/R[23]测序，测序结果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行序列比对，选取相似度最高的结果进行系统进化树的构建。

1.3.4 PCR 扩增

实时荧光PCR 反应体系为20 μL ∶0.2 μL 的TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL），4 μL 的10×Ex Taq Buffer，3 μL的dNTP 混合液（2.5 mmol/L），0.4 μL 的ATP6-F（10 μmol/L），0.4 μL 的ATP6-R （10 μmol/L），0.6 μL 的Probe（10 μmol/L），9.4 μL 的无菌水，2 μL 的DNA。

参照LightCycler480 II 实时荧光PCR 仪使用说明书及TAKARA 公司TaKaRa Ex TaqRHot Start Version推荐的反应程序，设置反应程序：95 ℃预变性30 s，1 个循环；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40 个循环；40 ℃冷却30 s，1 个循环。

2 结果分析

2.1 样品真实性鉴定

利用DNA 条形码技术验证收集样品真实性和准确性的结果如图1 和表3 所示。 本研究所收集样品和NCBI 数据库序列比对相似度达99.9%。

表3 18 种鱼类样品名称及测序结果Table 3 Names and sequencing results of 18 fish samples

图1 18 份样品的线粒体上COX I 的最大似然法和邻接法分子进化树Fig.1 The maximum likelihood and neighbor joining molecular evolutionary trees of COX I on the mitochondria of 18 samples

2.2 特异性试验

选取青海不同虹鳟养殖场的虹鳟10 份，市售不同种类的鱼17 份，用引物ATP6-F/R 进行PCR 扩增，结果如图2 所示。

图2 虹鳟源性成分检测的特异性试验Fig.2 Specific detection of rainbow trout-origin components

在32 个循环之前只对虹鳟进行了扩增， 对其它（大西洋鲑鱼、带鱼、大黄鱼、中国芦花、秋刀鱼、尼罗罗非鱼、草鱼、鲅鱼、大眼鳜、石斑、蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大目金枪鱼、长鳍金枪鱼、比目鱼、锦鲤、鲫鱼）17种鱼、空白对照未见扩增曲线，说明该方法特异性良好，可用于虹鳟源性的样品的检测判定值为32 个循环，在32 个循环之前出现明显扩增曲线的，判定为阳性；在32 个循环之前未出现明显扩增曲线的，判定为阴性。

2.3 DNA 灵敏度试验

验证TaqMan 探针方法的DNA 灵敏度结果如图3 所示。

由图3 可知，在这6 个浓度梯中50、10、1、0.1 ng/μL在32 个循环前有扩增，0.01、0.001 ng/μL 在32 个循环之前无扩增，表明本方法的灵敏度为0.1 ng/μL。

图3 DNA 浓度灵敏度试验Fig.3 Sensitivity of different DNA concentration

2.4 市售样品的检测结果

对表1 中1 号～22 号样品的检测结果如图4 所示。

由图4 可知，2 份市售三文鱼生鱼片和8 份网购的三文鱼及制品在32 个循环之前出现明显扩增曲线，判定为阳性即检出虹鳟源性成分， 另外2 份市售三文鱼生鱼片和10 份网购的三文鱼及制品在循环之前未出现明显扩增曲线的，判定为阴性即未检出虹鳟源性成分；对扩增结果进行测序分析，测序结果与测试结果一致。

图4 市售样品检测的DNA 扩增谱图Fig.4 DNA amplification profile of commercially available samples

3 结论

本研究首先对收集的样品用线粒体COX I 基因的部分特异区段设计的引物FISH F/R 进行扩增测序，验证了收集样品的真实性；进而通过设计虹鳟特异性的引物探针， 建立了针对虹鳟源性成分的实时荧光PCR 检测方法，利用17 种市场常见鱼类进行检测，结果表明本方法特异性良好，并根据试验数据设定32 个循环以后出峰的是未检出样品，为阴性；经DNA 梯度稀释验证本方法的灵敏度为0.1 ng/μL， 对市售22 份标有鲑科鱼源性成分的样品进行测试，表明本方法可用于对市售产品中虹鳟源性成分的鉴别，同时也表明虹鳟是市售三文鱼的主要鱼种之一。