IL-15Rα及RUNX2基因多态性与内蒙古地区蒙古族后纵韧带骨化的相关性研究

李鹏飞，朱淑芬

(内蒙古自治区人民医院脊柱外科，内蒙古 呼和浩特 010017)

随着年龄增长，在众多因素作用下，后纵韧带组织中新生异位骨结构形成而逐渐发生骨化，导致椎管、椎间孔狭窄，压迫脊髓、神经根，临床上出现脊髓损害症状及神经根刺激症状，即为后纵韧带骨化症(ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL)。OPLL是一种病因尚未明确的病理现象。据统计，脊柱OPLL中70%发生于颈椎，胸椎仅占15%[1]，国内外未发现有发生于腰椎的报道。颈椎OPLL是脊髓型颈椎病的主要病因之一[1]，其预后差异很大，症状可以从一直处于无症状的稳定状态到短时间内出现四肢瘫痪[2]。大量临床研究已经证实，OPLL为一种遗传因素和外界因素共同作用所致的复杂疾病。外界因素包括慢性退行性变，内分泌和代谢性疾病，糖尿病、饮食、高氟及高铜等均与OPLL有关[3]。我院脊柱外科2014年1月至2019年12月共收治颈椎OPLL患者620例，其中蒙古族患者为241例，占总数为31.2%，高于本地区蒙古族人口比例。虽然在流行病学上蒙古族OPLL还无相关调查，但由临床上看本地区蒙古族OPLL发病率较高，发病程度较重，因此，蒙古族OPLL基因多态性研究较有意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月至2019年12月就诊于内蒙古自治区人民医院脊柱外科门诊或住院部的蒙古族OPLL患者，以及同期健康体检的蒙族人群为研究对象。纳入标准：OPLL患者及健康组均符合祖籍三代及三代以上居住在内蒙古地区无血缘关系、无异族通婚史疾病病史，无氟骨症病史、无高血压、糖尿病等慢性基础疾病，无肿瘤、自身免疫性疾病及其他家族性遗传疾病的病史。排除标准：有血缘关系、有异族通婚史疾病病史，有氟骨症病史、有高血压、糖尿病等慢性基础疾病，有肿瘤、自身免疫性疾病及其他家族性遗传疾病的病史。

根据纳入及排除标准，共有110例内蒙古地区蒙古族后纵韧带骨化患者，其中男75例，女35例；年龄38～78岁，平均(53.0±12.8)岁。118例健康蒙古族人群，其中男65例，女53例；年龄45～68岁，平均(58.0±11.2)岁。研究对象年龄、性别构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本实验经医院伦理委员会同意，并且入选检测者均签署知情同意书。

1.2 方法 采用基因测序法对110例内蒙古地区蒙古族后纵韧带骨化患者和118例健康蒙古族人群进行白细胞介素15受体α亚单位(interleukin-15 receptor α subunits，IL-15Rα)基因及Runt相关转录因子2(recombinant Runt related transcription factor 2，RUNX2)基因多态性的检测。

1.2.1 基因组DNA提取 所有入选对象采外周静脉血3 mL，乙二胺四乙酸(ethylenediammine tetracetic acid，EDTA)抗凝，采用天根生化科技有限公司提供的全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，-80℃保存备用。

1.2.2 引物设计 根据GenBank提供的基因序列，将单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点作为靶序列，根据SNP位点两侧的保守序列设计引物，引物设计在NCBI网站上进行，设置的主要参数为：引物长度一般为18～24 bp；理论退火温度Tm值55～65℃；(G+C)含量40%～70%；扩增片段大小<800 bp。由天根生化科技公司合成引物序列，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)引物信息见表1。采用SNaPshot分型方法进行分型，对分型结果进行双盲样本质控和阴性对照质控。

1.2.3 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增目片段 引物设计合成并确认DNA模板质量合格的情况下，进行PCR扩增，PCR反应体系总体系为25 μL，包括：基因组DNA 1 μL，酶0.5 μL，10×buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，三磷酸碱基脱氧核苷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTPs)0.5 μL，dd H2O 19.5 μL；PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃终末延伸10 min。PCR产物经3%琼脂糖电泳检测，于紫外灯下观察是否有条带及条带亮度。

1.2.4 DNA序列测定 测序PCR反应所选用的试剂为ABI公司的BDT3.1测序试剂盒(Big Dye Terminator v3.1)，测序反应均按照BDT3.1使用手册进行。测序PCR产物的纯化采用BDT3.1使用手册中的乙醇沉淀方法，干燥后4℃避光保存。甲酰胺变性需加入10 μL甲酰胺，将纯化后的干粉充分溶解，随后置于PCR仪中进行变性反应。最后上样测序，将变性后的样品采用3730XL进行测序。

表1 PCR-RFLP引物信息

2 结 果

健康蒙古族118例与蒙古族OPLL 110例采用χ2检验对rs1321075位点基因型、等位基因频率进行比较，AC、CC型差异有统计学意义(P<0.05)，OR值(95%CI)分别为0.584(0.343，0.997)、1.978(1.166，3.353)，等位基因C的OR值(95%CI)为0.588(0.386，0.895)；对rs16873379位点基因型、等位基因频率进行比较，CT、TT型差异有统计学意义(P<0.05)，OR值(95%CI)分别为2.756(1.595，4.760)、0.266(0.153，0.461)，等位基因C的OR值(95%CI)为2.514(1.678，3.768)；对rs2296139位点基因型、等位基因频率进行比较，AA基因型差异有统计学意义(P<0.05)，OR值(95%CI)为0.416(0.218，0.797)；其他位点基因型、等位基因频率进行比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2 两组RUNX2基因及IL-15Rα基因型和等位基因频率分布比较

3 讨 论

OPLL是一种高发于东亚地区的常见病。日本的发病率为1.9%～4.3%，韩国约为3.6%，中国台湾约为2.8%，而北美白人仅为0.12%[4-5]。根据李中实等[6]的调查，中国北方人群的OPLL发病率为0.44%～8.92%。1981年日本颈椎OPLL患者直系亲属与其他亲属的OPLL发病率分别为23%和22%，而普通人群仅为3.7%[7]，这表明颈椎OPLL有基因遗传基础。因调查人群中兄弟姐妹间种族隔离率为0.26，大于隐性特性的理论最大值0.25，故推测其为显性遗传。Terayama[8]调查了347例OPLL患者家庭，共1 030例家庭成员，发现影像学表现为OPLL的患者父母达26.5%，兄妹中发现OPLL的占28.89%，符合常染色体显性遗传特点。2003年，Tanaka等[9]采用全基因组扫描手段，研究了142例日本OPLL患者，发现1p、6p、11q、14q、16q和21q可能为OPLL的易感基因区域，而位于21q22·3的微卫星标志D21S1903具有强烈的关联性。目前怀疑的易感基因包括胶原11A2(COL11A2)、胶原6A1(COL6A1)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1)重组蛋白、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、瘦素受体、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)、视黄酸X受体β(retinoid X receptorretinoid β，RXRβ)、雌激素受体、白细胞介素(interleukin，IL)-1、RUNX2、血管生成素-1(angiopoietin-1，ANG-1)以及G蛋白偶联嘌呤受体P2Y1(G protein coupled purinergic receptor，P2RY1)等[10]。2016年陈欣等[11]报道，利用目标基因测序技术，对11个已知OPLL致病基因进行了检测，发现COL11A2是OPLL易感基因。

Runt相关转录因子(recombinant Runt related transcription factor 2，RUNX)家族的转录因子协调了细胞的各种发育过程，如细胞增殖、分化和细胞谱系专项分化。RUNX基因是根据发育调控基因Runt的发现命名的，Runt被认为是早期胚胎分割的关键。RUNX转录因子包括RUNX1、RUNX2和RUNX3。RUNX2是骨骼发育的主要调节因子，在成骨细胞和软骨细胞谱系的规范和分化中发挥多种作用[12]。软组织中的新生骨形成是通过间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化为成骨细胞来实现的，成骨细胞成熟为骨细胞并最终形成骨，这一过程称为膜内骨化，RUNX2基因是MSCs向成骨细胞分化的特异性转录调节因子。成骨细胞的命运选择和导致膜内骨化的成熟途径在很大程度上由RUNX2控制。软骨分化则由RUNX2和RUNX3共同调节[12]。Kishiya等[13]应用DNA微阵列检测RUNX2基因表达，发现韧带骨化症患者RUNX2基因表达增强。他们将骨化的后纵韧带细胞进行体外培养，然后应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)抑制RUNX2基因的表达，发现骨化细胞促血管生成素-1表达明显下调，而正常细胞的表达没有明显差异，提示促血管生成素-1在脊柱韧带异位骨化过程中也起重要作用。Liu等[14]以COL6A1、RUNX2、BMP-2、维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)4组基因，对82例OPLL患者及118例健康对照进行了研究，得出RUNX2的RS1321075及RS12333172两个位点与OPLL强烈相关。

IL-15是继IL-2之后被发现的又一重要的T细胞生长因子，它的生物学活性广泛，经证明在某些临床疾病中有其独特的作用，IL-15Rα是白细胞介素15受体异源三聚体(interleukin-15 receptorαβγsubunit，IL-15Rαβγ)的重要组成部分。除了参与高特异、高亲和力受体的组成外，IL-15Rα还具有一个非常罕见的特性，即无需β和γ亚单位的参与，其独自便能够以极高的亲和力同IL-15结合。IL-15Rα在免疫发展和功能作用上起重要作用，它与IL-15的高度亲和性使它在IL-15的信号传导上起重要作用。IL-15Rα是促炎信号转导的重要组成部分，由于其参与多种生理和代谢过程而日益受到人们的重视。IL-15和IL-15Rα水平在运动引起的低度炎症中急剧升高[15]，在类风湿性关节炎等病理条件下也有慢性升高，尤其是在关节滑液中可以升高[16]。Petrovic-Rackov等[17]报道，在骨关节炎和类风湿性关节炎的患者血清和滑液中IL-15水平明显高于骨关节炎的患者，且与疾病活动相关。IL-15Rα基因的SNP与骨量有关[17]。Loro等[18]研究IL-15Rα在成骨细胞调节和骨矿化中的作用，证明IL-15Rα是保证成骨细胞/破骨细胞有效结合所必需的，在决定成骨细胞磷酸稳态和矿化能力方面起重要作用，尤其对皮质骨矿化至关重要。

Kim等[19]首先报道，通过研究166例OPLL患者和230例健康人群对比，IL-15Rα的(rs2228059，Asn182Thr)多态性可能与韩国人OPLL的易感性有关。Guo等[20]报道，通过研究235例汉族OPLL患者和250例汉族健康人群，也得出IL-15Rα的(rs2228059，Asn182Thr)多态性是OPLL的易感因素。

本实验采用基因测序法对内蒙古地区蒙古族OPLL患者110例进行RUNX2基因及IL-15Rα基因多态性的检测，发现蒙古族OPLL患者都与rs1321075位点、rs16873379位点和rs2296139位点有关。rs1321075位点AC型、等位基因C可能为保护因素，CC型可能为危险因素；rs16873379位点CT型、等位基因C为危险因素，TT型为保护因素；rs2296139位点AA基因型为保护因素，其他位点基因型、等位基因频率进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)

综上所述，RUNX2基因及IL-15Rα基因中rs1321075位点、rs16873379位点和rs2296139位点基因多态性，在内蒙古地区蒙古族OPLL人群中可能起到一定的作用。