超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱快速筛查蔬菜中18种农药残留

林守二， 杨丽娟， 郑仁锦， 黄丽英*

(1.福建医科大学药学院，福建福州 350122；2.福建省疾病预防控制中心，福建福州 350001)

蔬菜与人们生活息息相关，其在栽培过程需要喷洒农药预防虫病危害。近年来，农药残留问题已成为影响蔬菜质量安全的一个重要因素[1 - 3]。多菌灵、甲基硫菌灵、甲霜灵、嘧霉胺、烯酰吗啉、三唑酮、戊唑醇、丙环唑、咪鲜胺、苯醚甲环唑为杀菌剂，在全球的农药市场中，杀菌剂的市场份额占比较大[4]；吡虫啉、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺、茚虫威为杀虫剂，为烟碱类农药，通过与害虫体内尼古丁乙酰胆碱受体结合而将其杀死，但与人和动物体内该受体也会结合而造成危害[5]；6-苄氨基嘌呤、抗倒酯、多效唑、烯效唑为植物生长调节剂，是一类与植物内源激素具有相似生理功效的人工合成物，使用后可使蔬果产量增加，但过量使用对人体有明显的慢性毒性[6]。这三类共18种农药皆为蔬菜中的常用农药，且在国家食品安全风险监测中检出率较高，因此，建立合适方法同时快速筛查并规范他们的使用具有重要意义。

蔬菜中农药残留的前处理方法有很多，而QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)法被广泛用于农药残留的前处理[7 - 9]。农药残留的检测方法主要有电化学法[10]、液相色谱法[11,12]、免疫分析法[13]、生物传感器法[14]、毛细管电泳-串联质谱法[15]、气-质联用法[16 - 18]、液相色谱-三重四极杆-质谱法[19 - 21]、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrpole-Time of Flight Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF MS)[22 - 24]等。其中UPLC-Q-TOF MS为高分辨质谱，可精确测定多组分目标化合物分子量，比其它方法在确证分析中具有更大优势。目前Q-TOF MS在农药多残留筛查中多使用一些通用数据库作分析[25]，但其保留时间受实验室实际分析条件限制无法作为定性依据，而应用自建的数据库不仅可根据母离子精确分子量及二级碎片离子相匹配，且可利用保留时间加以定性，具有基质干扰小、定性准确度高等优点。

本实验利用UPLC-Q-TOF MS法结合QuEChERS前处理技术，优化前处理条件及检测条件，选用1%乙酸乙腈提取，QuEChERS法(MgSO4+C18)净化，自建谱库筛查蔬菜中的常用农药，包括杀菌剂、杀虫剂以及植物生长调节剂三类共18种农药的残留。通过精确质量数、保留时间以及二级碎片离子信息匹配，且所建谱库可用于再次检测的无标准溶液直接定性，具有简单、快速、准确的优势，可用于蔬菜中多农药残留的快速筛查。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290-6545超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪，配有Dual AJS ESI源(美国，Agilent公司)；BSA124S分析天平(德国，Sartorius公司)；Multi Reax自动涡旋混合器(德国，Heidolph公司)；Allegra X-30离心机(美国，Beckman Coulter公司)。

18种农药标准品：多菌灵、吡虫啉、啶虫脒、6-苄氨基嘌呤、甲基硫菌灵、甲霜灵、抗倒酯、氯虫苯甲酰胺、嘧霉胺、烯酰吗啉、多效唑、三唑酮、烯效唑、戊唑醇、丙环唑、咪鲜胺、苯醚甲环唑、茚虫威，纯度均大于98%，均购于北京迪马科技有限公司。脱水试剂包(内含6 g无水MgSO4和1.5 g NaAc)，QuEChERS试剂包(内含150 mg MgSO4，25 mg C18，德国CNW公司)。甲酸(色谱纯，德国CNW公司)，乙酸(色谱纯，德国CNW公司)，甲酸铵(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，无水MgSO4(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

蔬菜样品采集于福州的超市及农贸市场，所有样品取可食部份匀浆后，于-18 ℃保存备检。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制分别准确称取18种农药标准品10.00 mg，用乙腈配制成1.0 mg/mL的标准储备溶液，然后分别稀释得18种农药为10 μg/mL的标准储备溶液。用各个标准储备溶液制得含18种农药500 μg/L的混合操作溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 样品提取称取5.000 g经匀浆后的蔬菜样品于50 mL离心管中，加入10.00 mL 1%乙酸乙腈，涡旋振荡2 min，于4 ℃冰箱中放置15 min后，加入脱水试剂包，迅速摇匀，涡旋振荡1 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液1.00 mL加入至含QuEChERS试剂包管内，涡旋后离心5 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜后，待测定。若遇组分峰面积超出线性范围，则需要根据超出情况用空白基质溶液稀释至合适浓度后进行测定。

1.3 UPLC与MS/MS检测条件

1.3.1 UPLC条件Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；流动相A为含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序为：0～6 min，10%～30%B；6～20 min，30%～80%B；20～26 min，80%～95%B；26～30 min，95%～95%B。流速：0.25 mL/min；进样量：2 μL；柱温：30 ℃。

1.3.2 MS/MS条件电喷雾离子源(ESI)；正离子(ESI+)扫描；扫描范围m/z50～1100。干燥气温度：280 ℃；干燥气流速：8 L/min；毛细管电压：4 000 V；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；Fragmentor：120 V；参比离子为m/z121.0509/922.0098，用于实时校正；MS及MS/MS模式下采集质谱数据。

1.3.3 谱库的建立18种农药的分子式、精确质量数、母离子及保留时间等信息见表1。

表1 18种农药的分子式、精确质量数、母离子、特征碎片离子和保留时间

(续表1)

在系统自带的PCDL软件中输入目标组分的名称、CAS号、分子式，自动生成精确分子量，为一级谱库。在全扫描模式下对18种农药的混合标准溶液按仪器的检测条件进行检测，并通过Find by formula匹配到一级谱库，更新各组分的保留时间。

在已建立的一级谱库的基础上，将所得化合物的母离子及保留时间导入到Targeted MS/MS的Target list的列表，设置三个不同碰撞能量，设置碎片离子扫描范围为m/z50～1100，得到不同碰撞能量下碎片离子的质谱图，添加到PCDL的一级谱库中，即建成18种目标化合物的二级谱库。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

2.1.1 前处理条件的选择实验中发现，提取溶剂选用乙酸-乙腈(1∶99，V/V)时，各组分提取效率均较高。在使用QuEChERS法净化时，试剂包中的无水MgSO4常作为脱水试剂，N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)和石墨化碳黑(GCB)常作为吸附剂。其中PSA一般用于去除样品中的碳水化合物，C18主要用于吸附脂肪和酯类等非极性物质，而GCB则用于吸附色素。本实验研究发现，当净化剂中加入PSA，6-苄基腺嘌呤回收率降低(降至70%以下)；而加入GCB时，具有平面π-π结构的多菌灵和嘧霉胺的回收率均明显下降。18种农药中多菌灵是一种苯并吡唑类农药，极性较小，C18的加入虽然使其回收率有所下降，但在不同基质中的加标回收均大于79%，因此认为C18可作为净化剂的备选。选取空白基质混合溶液作为样品基质，加与不加C18时的总离子流色谱图中，色谱基线差异不明显；在目标组分响应上，加入C18后，多菌灵响应略微下降，但响应本就比较低的抗倒酯、烯酰吗啉和多效唑响应值均上升，其他组分响应影响不明显。综合考虑需要加入C18作为净化剂。因此，最终选用1%乙酸乙腈提取，QuEChERS法(MgSO4+C18)净化。依据本课题组先前研究以及文献中对于净化剂常用量的考察[26 - 28]，选用QuEChERS试剂包(内含150 mg MgSO4，25 mg C18)。

2.1.2 检测条件的选择甲醇-水、乙腈-水常作为液-质分析的流动相，实验发现用乙腈-水作为流动相时，体系压力较低，且水相中加入含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵溶液后目标组分的峰形较佳，因此液相条件使用乙腈与含0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸铵溶液梯度洗脱。在每次实验前，均需对仪器调谐校正。设置预碰撞解离电压分别为80、120和150 V，比较各组分的响应值，最终选择各组分响应均较高的120 V。

2.1.3 定性筛查与确证在实际样品分析中，采用MS结合碰撞能量的模式扫描采集数据，根据“1.3.3”建立的筛查谱库，18种农药化合物均能被准确确证。提取离子色谱图(EIC)见图1。

图1 18种农药的提取离子色谱图Fig.1 The extracted ion chromatogram of 18 pesticides1.Carbendazim；2.Imidacloprid；3.Acetamiprid；4.6-Benzyladenine；5.Thiophanate-methyl；6.Metalaxyl；7.Trinexapac-ethyl；8.Chlorantraniliprole；9.Pyrimethanil；10.Dimethomorph；11.Paclobutrazol；12.Triadimefon；13.Uniconazole；14.Tebuconazole；15.Propiconazole；16.Prochloraz；17.Difenoconazole；18.Indoxacarb.

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围、检出限和定量限18种农药均采用基质匹配外标法定量分析，以空白基质配制混合标准溶液，以浓度(X,μg/L)为横坐标，定量离子峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归计算。以3倍信噪比(S/N≥3)计算检出限(LOD)，以10倍的信噪比(S/N≥10)计算定量限(LOQ)。18种农药的线性范围、回归方程、LOD、LOQ见表2。相关系数(r)均大于0.9908，线性良好，检出限在0.0006～0.005 mg/kg之间，定量限在0.002～0.016 mg/kg之间。

表2 18种农药组分的线性范围、回归方程、相关系数、检出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.2.2 准确度及精密度分别选择不含目标化合物的豆芽、白菜和黄瓜空白样品，加入低、中、高3个水平的农药混合标准溶液，使得多菌灵、6-苄氨基嘌呤、甲基硫菌灵、甲霜灵、抗倒酯、嘧霉胺、烯酰吗啉、多效唑、三唑酮、烯效唑、戊唑醇、丙环唑、咪鲜胺、苯醚甲环唑、茚虫威终浓度为5、10、50 μg/kg，吡虫啉、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺终浓度为10、50、100 μg/kg，按“1.2.2”样品处理步骤前处理，优化仪器检测条件下检测，每个浓度水平平行测量6次，测得18种农药组分的平均回收率为73.56%～103.2%，相对标准偏差(RSDs)为0.23%～9.85%，结果见表3。

表3 18种农残组分在不同基质中3个加标水平下加标回收率及相对标准偏差(n=6)

(续表3)

2.3 实际样品的确证与定量

实际样品按照前处理步骤和优化检测条件，使用Q-TOF的MS/MS模式，设置碰撞能量分别为0、10、30 eV采集数据，同时得到化合物的一级母离子的信息以及在设定碰撞能量下的二级碎片离子信息，用所建谱库筛查目标化合物，根据欧盟2002/657/EC决议，使用高分辨质谱作为确证技术时，检测到1个具有精确质量数的母离子、保留时间匹配、且二级质谱中的至少1个子离子匹配即可确证该化合物。

采用本实验建立的方法对市售60种蔬菜样品进行快速检测，根据我国国家标准(GB 2763-2019)[29]《食品中农药最大残留限量值》，没有具体规定的食品种类按限量值≤1 mg/kg计算，所得各组分的检出值范围在0.0021～4.38 mg/kg之间，总检出率为71.67%，总合格率为93.33%，具体结果见表4。其中超标的为菠菜(三唑酮1.02 mg/kg)，上海青(烯酰吗啉1.15 mg/kg)，茼蒿(丙环唑4.38 mg/kg)，香菜(丙环唑4.05 mg/kg)各1份。结果表明，市售蔬菜农药残留总体控制较佳，但依然有超标情况的出现，持续监测仍有必要。

表4 实际样品的检测结果

3 结论

本实验以1%乙酸乙腈提取蔬菜中的18种农药残留，并优化选择以MgSO4+C18作为QuEChERS净化剂净化样品提取液，通过调试质谱参数和色谱条件，建立18种农药的一级精确质量数据库以及二级谱图库，采用UPLC-Q-TOF MS方法同时快速筛查28种蔬菜中18种农药残留。QuEChERS前处理方法操作简便、试剂消耗量小、净化效果好，而UPLC-Q-TOF MS为高分辨质谱，基质干扰小、定性准确度高，为蔬菜中多残留农药的持续监测提供方法参考。本实验所筛查农药种类为18种常用农药，有希望继续使用自建谱库的方法一次筛查更多种类的农药，争取完成农药多残留的无标准品快速筛查。