高效液相色谱法测定苹果和西红柿中腈菌唑对映体含量

张天赐， 钟 慧， 双亚洲， 曾庆丽， 李 良， 李来生*,2

( 1.南昌大学化学学院，江西南昌 330047；2.南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047)

手性农药通常只有一种对映体能高度匹配蛋白质等生命物质的立体结构，显示出很高的农药活性，而其余没有活性的对映体往往很难被生物降解，并且可以通过环境和食物链在生物体中广泛传递，对人类的生活和生殖健康带来深远的影响，故生物体内手性农药对映体的选择性效应已引起国际社会高度关注[1]。腈菌唑(Myclobutanil，图1)，化学名称是2-(4-氯苯基)-2-(1H,1,2,4-三唑-1-甲基)己腈，它能够抑制表角甾醇的生物合成,破坏细胞膜，导致病原菌死亡，具有很强的杀菌作用，是一种农业生产中广泛使用的三唑类手性杀菌剂，对多种农作物的白粉病、锈病、黑病、灰斑病、褐斑病具有很好的防治效果[2]。动物试验表明腈菌唑具有急性毒性，可破坏类固醇激素影响试验动物的繁殖能力，并引起肝细胞的损伤，已被美国环境保护署(EPA)列为潜在的人类手性致癌物[3,4]。由于各种原因，目前腈菌唑仍以外消旋体形式销售和使用，随着手性杀菌剂用量的增大，对映体带来的生物毒性潜在风险加大，因此，开发有关手性农药对映体的分析方法，对科学评估其在环境和食品中的迁移、毒性和降解行为，乃至食品安全都具有重要的意义。

图1 腈菌唑对映体的化学结构Fig.1 The chemical structure of myclobutanil enantiomers

由于对映体的物理和化学性质几乎相同，使得手性拆分非常困难。拆分腈菌唑的方法主要是色谱法[5 - 8]，但以高效液相色谱法(HPLC)应用居多，而成功拆分的关键在于选用合适的手性固定相。目前只有纤维素类和直链淀粉类固定相能成功拆分腈菌唑的报道。2004年Pan等[9]比较了不同衍生基的纤维素固定相在正相色谱条件下拆分腈菌唑的能力，包括苯甲酰化(CTB)、4-甲基苯甲酰化(CTMB)、苯氨基甲酸酯化(CTPC)和3,5-二甲苯氨基甲酸酯化(CDMPC) 4种纤维素固定相。研究发现它们的拆分能力依次为CDMPC>CTPC>CTMB>CTB。Wang等[10]分别采用含苯乙基、苯基和3,5-二甲苯基的氨基甲酸酯衍生化直链淀粉固定相，以含5%～10%异丙醇的正已烷作为流动相，成功地拆分了腈菌唑，分离度(RS)分别为1.49、1.47和5.73，后者占有明显的优势。Tian等[11]把纤维素和直链淀粉的3,5-二甲苯基的氨基甲酸酯衍生物分别涂覆到硅胶表面，发现纤维素类固定相对腈菌唑的拆分能力明显优于直链淀粉类固定相，但需要在较低的柱温下拆分。近年来，耐溶剂的多糖类固定相如Chiralcel OD -RH、Chiralpak AD、Lux Cellulose -1等在反相色谱条件下拆分腈菌唑的应用增多，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用技术所分析的样品包括水、土壤、黄瓜、草霉、蚯蚓和兔子等[12 - 16]。

环糊精类固定相是一类拥有包结作用的常用手性固定相[17]，与多糖类固定相相比，环糊精键合时无需大孔硅胶，键合方法便利，耐溶剂性能好，制备成本较低，且能在多种色谱分离模式下使用。目前，只有采用羟丙基或磺酸基β-环糊精作毛细管电泳手性添加剂成功拆分腈菌唑的报道[18,19]，尚未见采用环糊精类固定相的HPLC法拆分腈菌唑的实例。我们实验室也曾制备系列衍生化环糊精固定相，发现它们对手性碳上含羟基的三唑农药有拆分能力，但对不含羟基的腈菌唑没有拆分迹象[20]。最近，又制备得到一种含苯甲酰胺连接臂的β-环糊精键合相(TCDP，图2)，发现尽管它的结构简单，却能在短时间内完全拆分腈菌唑。为此，本文拓展环糊精类固定相在测定常见果蔬中腈菌唑对映体分析方面的新应用。环糊精类固定相更适合反相色谱，所建立的液相色谱方法简便，定量准确，重现性好，测试成本较低，能快速监测该手性农药的残留，具有较好的研究意义和应用价值。

图2 含苯甲酰胺连接臂的β -环糊精手性固定相的结构Fig.2 The structure of β -cyclodextrin bonded phase(TCDP) with benzamide spacer

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ZQ 4000/2695液相色谱-质谱联用仪，配有2996二极管阵列检测器和Masslynx 4.1色谱软件(美国，Waters公司)；5600+四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪(美国，AB SCIEX公司)；Vario EL Ⅲ元素分析仪(德国，Elementar公司)；AW-60色谱装柱机(美国，Haskel公司)；HR1853果汁机(飞利浦(中国)公司)；MS-3迷你振荡器(德国，IKA公司)；HSC-12A氮吹仪(南京科捷分析仪器有限公司)；KQ-100E数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

γ-异氰酸丙基三乙氧基硅烷购于Sigma公司；硫代水杨酸、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)购自阿拉丁试剂(上海)公司；外消旋的腈菌唑标准品(纯度≥99%)购于上海农药研究院；色谱纯甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)购于美国Tedia公司；样品前处理用的N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)和石墨化炭黑(GCB)购自博纳艾杰尔科技公司(天津)；Fe3O4磁性纳米粒子参考Zheng等[21]报道的方法制备；无水MgSO4、NaCl、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮和其他分析纯试剂均购于国药集团化学试剂有限公司(上海)。实验所用超纯水由Milli-Q超纯水制备装置(美国Millipore公司)制备。

实验用苹果和西红柿样品从南昌市周边市场随机采购。

1.2 含苯甲酰胺连接臂β -环糊精键合相制备

有序介孔硅胶SBA-15和单6-氨基-β-环糊精分别按文献方法[22,23]制备，SBA-15粒径2.5～4.5 μm，比表面积约为400 m2/g。主要合成过程：将2.0 g干燥的单6-氨基-β-环糊精和0.31 g硫代水杨酸溶解在40 mL DMF中。加入0.3 g DCC和0.3 g HOBT作脱水剂，混合物在氮气保护下室温搅拌反应48 h。倒入丙酮至溶液后析出沉淀，用少量热水溶解后加丙酮重新析出沉淀，固体真空干燥后得到2-巯基苯甲酰胺基-β-环糊精，产率66%。ESI([M-H]-,m/z)为1268.3854，与理论值(1268.3762)基本相同。将上步中间产物溶解于50 mL无水DMF中，加入0.3 mLγ-异氰酸丙基三乙氧基硅烷偶联剂和3.0 g SBA-15，搅拌下95 ℃继续反应24 h。将滤出的粗产品依次用DMF、甲醇、丙酮反复洗涤，经真空干燥后得到产物TCDP固定相。

1.3 腈菌唑标准溶液的配制

精密称取一定量的外消旋的腈菌唑标准品，用甲醇溶解并配制100 μg/mL的储备溶液，由于含等量的对映体，单一对映体浓度为50 μg/mL。然后分步用甲醇稀释，得到一系列浓度梯度的外消旋腈菌唑标准溶液，单一对映体浓度范围为0.5～50 μg/mL，用0.22 μm有机微孔相滤膜过滤后装入进样瓶中，超声脱气后进样分析。

1.4 色谱分析条件

采用自制的TCDP为色谱固定相，用匀浆填充法装柱(150 mm×4.6 mm)；流动相为不同体积比的甲醇-水或乙腈-水，使用前经滤膜过滤和超声脱气处理。首先对流动相组成和柱温进行优化，使腈菌唑对映体能在较短时间内完全分离。实验发现甲醇-水=20∶80(V/V)与乙腈-水=12∶88(V/V)都能完全拆分腈菌唑，但乙腈紫外吸收较弱，对检测干扰相对较小，所以本实验选用乙腈-水=12∶88(V/V)作为流动相，流速为0.5 mL/min。设定二极管阵列检测器的波长范围为200～250 nm，定量检测波长为221 nm，柱温设为20 ℃，进样量为10 μL。

1.5 样品前处理方法

根据文献方法[21]制备Fe3O4磁性纳米粒子进行提取、净化和浓缩。釆用改进的QuEChERS方法提取果蔬中腈菌唑农药残留。主要步骤如下：首先将新鲜的苹果和西红柿样品切片，用蔬菜捣碎机制成果浆。称取10 g果浆样品于50 mL的Eppendorf塑料管中，加入10 mL乙腈，涡旋匀浆。然后加入4.0 g无水MgSO4和1.0 g NaCl，再次涡旋，防止结块。在5 000 r/min下离心10 min，并将上层清液转移至一支预装有1.0 g无水MgSO4的Eppendorf塑料管中，涡旋处理后静置，取上清液1.0 mL加入到一支2 mL 的离心管中(管中预装有50 mg PSA，40 mg GCB和60 mg Fe3O4磁性纳米粒子)，用力振摇，通过外部磁铁快速澄清，收集清液。清液经氮吹后用少量甲醇复溶，用0.22 μm滤膜过滤后，进样分析。

2 结果与讨论

2.1 含苯甲酰胺连接臂β -环糊精键合相的键合量

TCDP固定相经60 ℃真空干燥12 h后进行元素分析，两次平均结果为：C,4.88%；H,0.92%；N,0.33%。基于C含量计算出固定相的平均键合量约为0.194 μmol/m2。后续的实验表明TCDP能完全拆分腈菌唑，且保留时间和分离度重现性好，表明环糊精配体已被牢固地键合到硅胶上，其手性分离功能满足对映体定量分析要求。

2.2 TCDP拆分腈菌唑分离条件的优化

2.2.1 固定相与流动相的选择对映体的结构和物理化学性质几乎相同，手性拆分困难，为了提高拆分效率，必须优化流动相的组成。本实验选用反相色谱分离模式，并尽量釆用简单的流动相。实验发现，在新型的β-环糊精柱上，常见的甲醇-水或乙腈-水可完全拆分腈菌唑，无需添加酸、碱和缓冲溶液。由于采用二极管阵列检测器，需要在较低波长(221 nm)检测腈菌唑，所以选用截止波长较低的乙腈-水作流动相，同时乙腈的洗脱强度比甲醇大，有利于快速分析。图3为流动相中乙腈含量对腈菌唑分离度的影响。从图中可以看出，随着流动相中乙腈的体积分数从5%提高到15%，分离度先增后减；当其体积分数超过15%时，分离度迅速降低，可能是因为在反相色谱条件下，乙腈洗脱能力较强，会显著削弱腈菌唑与环糊精配体间的包结作用力，导致手性分离度下降，选择乙腈体积分数12%就可拆分腈菌唑。我们实验室以前合成的一系列衍生化环糊精固定相对腈菌唑也无拆分能力[20]。最近我们制备的TCDP固定相能快速拆分腈菌唑，可能与苯甲酰胺基连接臂参与了手性识别有关。所以本文选用TCDP和乙腈-水=12∶88(V/V)分别作为固定相和流动相，建立一种测定苹果、西红柿果蔬中腈菌唑对映体含量的新方法，以期拓展环糊精手性固定相的应用范围。

图3 流动相中乙腈含量对腈菌唑对映体分离度的影响Fig.3 The effect of ACN content in mobile phases on the resolution of myclobutanil enantiomers

采用不同的流动相流速(0.3～0.8 mL/min)进行拆分，实验发现如果流速太快，腈菌唑洗脱快，与固定相的作用力不够，导致手性分离度低；当流速太慢，分离时间变长，还会造成峰展宽。对于15 cm的手性柱，适宜的流速为0.5 mL/min。

2.2.2 柱温的选择温度能同时影响色谱中的热力学平衡和扩散传质动力学过程，从而影响手性分离选择性。本实验探讨了常见温度范围(即15～40 ℃)对腈菌唑分离参数的影响(表1)。从表中数据可以看出，随着柱温的升高，溶质洗脱加快，分离度也降低(1.72～0.52)，应该与焓控制有关[24]。本文选用20 ℃作为柱温，因为在该温度下分析时间较短，同时能完全拆分腈菌唑。

表1 柱温对腈菌唑对映体分离参数的影响

2.2.3 进样量的选择进样量与分离度、检出限和重现性有关。进样量较低时，腈菌唑的检测信号易受噪声干扰；进样量较高时会降低分离度。本实验发现10 μL进样量较合适。

2.2.4 检测波长的选择扫描腈菌唑标准品溶液紫外-可见光谱，实验发现腈菌唑在221 nm有较强的紫外吸收，260 nm仅有弱的吸收，因此设置检测波长为221 nm。

2.3 腈菌唑标准品和样品分析

2.3.1 工作曲线与外标法定量配制外消旋腈菌唑系列标准溶液，两对映体浓度均为0.5、2、5、10、20、50 μg/mL。从低浓度到高浓度依次进样，按上述优化的液相色谱条件分离和检测。在上述条件下外消旋腈菌唑标准品溶液的色谱图如图4所示。以腈菌唑浓度(x,μg/mL)为横坐标，相应的峰面积(y)为纵坐标，得到两种对映体的线性回归方程。按出峰顺序定义为对映体1和对映体2。对映体1：y1=211.25x1+70.28，r1=0.9992；对映体2：y2=203.74x2+69.13，r2=0.9981。

图4 流动相为乙腈-水(12∶88,V/V)时外消旋腈菌唑标准品溶液的色谱图Fig.4 Chromatogram of racemic myclobutanil standard by using acetonitrile-water(12∶88,V/V) as mobile phase(23.52 min and 25.67 min for myclobutanil enantiomers)

在同样的条件下，对前处理好的样品溶液进行测定，按外标法定量，并考虑前处理步骤的浓缩倍数。结果表明腈菌唑两对映体在0.5～50 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。按信噪比(S/N=3)推算出每个对映体最低检出浓度为0.04 μg/mL。

2.3.2 回收率试验分别向苹果和西红柿的阴性样品中添加外消旋腈菌唑标准品进行回收试验，单个对映体的浓度为5 μg/mL和10 μg/mL，每个样品连续测定5次，根据测得量的平均值与加入量之比计算平均回收率，见表2。从表中数据可知，该方法腈菌唑对映体有较高的回收率，苹果中所测得的两对映体的平均回收率分别为93.62%和93.34%，西红柿中所测得的两对映体的平均回收率分别为95.43%和94.80%。上述样品测定的相对标准偏差(RSD，n=5)为1.27%～2.01%，表明测定结果具有良好的重现性。添加外消旋腈菌唑的苹果(a)和西红柿(b)样品的色谱图见图5。

表2 苹果和西红柿中腈菌唑对映体的平均回收率(n=5)

图5 分别添加外消旋腈菌唑的苹果基质(a)和西红柿基质(b)的色谱图Fig.5 Chromatograms of spiked apple sample(a) and tomato sample(b) with racemic myclobutanil standard,respectively(23.40 - 25.65 min for myclobutanil enantiomers)

2.3.3 实际样品分析从市场上随机购买一批苹果和西红柿各15件作为样本。按照“1.5”方法进行前处理，根据“1.4”的高效液相色谱方法分离和测定腈菌唑对映体含量，每个样品重复测定3次，并将3次的平均值用作检测结果。尚未发现含腈菌唑的阳性样品。

3 结论

釆用自制的含苯甲酰胺连接臂的β-环糊精手性固定相(TCDP)，以乙腈-水作流动相，实现了腈菌唑对映体的完全分离，并建立了一种测定苹果和西红柿中腈菌唑对映体含量的新方法。TCDP结构简单，制备方法便利，采用环糊精类固定相首次成功地拆分腈菌唑，为该手性农药的有效拆分提供了一种新型的分离材料，为将来其在食品安全分析中的实际应用创造了条件。