具有聚集诱导发红光性质的邻菲啰啉钌配合物的合成及其细胞成像研究

王 慧*， 胡 磊， 沈学彬， 吴运军

(皖南医学院药学院，安徽芜湖 241002)

发光金属配合物在分子传感器、生物成像探针和光催化等诸多研究领域具有潜在的应用价值，已经成为近年来科学研究的热点[1,2]。一般来说，有机配体和金属配合物在稀的非水溶液中表现出明亮的荧光，但在聚集状态下或固态下由于聚集引起的猝灭(ACQ)而发出非常微弱的荧光。2001年，唐本忠研究小组报道了一种与ACQ完全相反的新现象，称之为“聚集诱导荧光增强”(AIE)效应[4]。AIE材料在良性溶剂中不发光或发出微弱的荧光，但这些材料在聚集态或固态下发出强烈的荧光。随着对AIE研究的不断深入，研究者们提出了很多机理，如形成J-聚集体、扭转的分子内电荷转移、分子内平面化、非紧密堆积、形成特殊激基缔合物等[5 - 7]。目前AIE材料已经广泛应用于生物传感、细胞亚细胞器成像和光动力学等研究方面[8 - 11]。虽然很多具有AIE效应的分子被报道，但大多数AIE分子的发射波段处于蓝绿光区，而具有红光发射特性的AIE材料(发射波长>600 nm)的种类和数量非常有限。红光AIE材料具有穿透能力强、对生物样品的损伤小、信噪比高等优势，但也存在量子产率低、光稳定性差等缺点[12]，因此，设计合成具有红光AIE效应的分子具有重要的科学意义。

Ru(Ⅱ)配合物具有较大的斯托克斯位移、好的光稳定性、长的荧光寿命等优势，已受到科研工作者越来越多的青睐[13,14]。邻菲啰啉具有较强的配位能力、好的平面性、容易修饰等优点，与Ru(Ⅱ)形成的配合物，已经被广泛应用于非线性光学材料、抗肿瘤药物和DNA探针等领域[15,16]。基于此，我们以4-丁氧基苯甲醛和邻菲啰啉双酮为原料，设计合成了一种新型的邻菲啰啉衍生物L，并于[Ru(phen)2]Cl2组装成相应的配合物LRu，在分子中引入丁基不仅能够增加电子的离域，而且能够提高分子的溶解性。研究了配合物LRu在不同极性的溶剂及不同体积比的乙醇和水混合溶液中的光学性质。初步探索了配合物LRu在Hela细胞中的成像情况。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance 600核磁共振仪(美国，布鲁克公司)；solanX 70 FT-MS质谱仪(美国，布鲁克公司)；Nicolet FT-IR-is5红外光谱仪(KBr压片)(日本，岛津有限公司)；UV-5900PC型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)；HITACHI F-4600荧光分光光度计(日本，日立公司)；INFINITE 200 PRO多功能酶标仪(瑞士，Tecan公司)；Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜(德国，徕卡公司)。

邻菲啰啉(99%)，溴代正丁烷(99%)，对羟基苯甲醛(98%)，NH4Ac，六氟磷酸钾(KPF6,99%)，三氯化钌水合物(35.0%～42.0% Ru basis)，氯化三(2,2′-联吡啶)钌(Ⅱ)·六水(98%)，其它试剂均为分析纯，购自阿拉丁试剂有限公司。

1.2 LRu的合成

1.2.1 化合物L的合成在250 mL三口烧瓶中，依次加入0.74 g(3.5 mmol)邻菲啰啉双酮[17]，0.62 g(3.5 mmol)4-丁氧基苯甲醛[18]，5.75 g(75 mmol)NH4Ac和75 mL冰HAc，在氮气保护下，120 ℃反应4 h，反应结束后，冷却至室温后，倒入大量冰水中，用饱和K2CO3溶液调节pH至7，有固体析出，减压抽滤，粗产物用甲醇重结晶，得淡褐色固体0.55 g，产率：42.9%。

1H NMR(600 MHz,d6-DMSO)：δ:8.98(d,J=4.0 Hz,2 H),8.87(d,J=8.0 Hz,2 H),8.18(d,J=8.5 Hz,2 H),7.77～7.79(m,2 H),7.11(d,J=8.4 Hz,2 H),4.02(t,J=6.4 Hz,2 H),1.74～1.66(m,2 H),1.49～1.38(m,2 H),0.91(t,J=7.4 Hz,3 H)。13C NMR(151 MHz,d6-DMSO)：δ:160.31,151.24,148.02,143.86,129.94,128.22,123.63,122.93,115.28,67.80,31.17,19.17,14.14。

1.2.2 配合物LRu的合成在100 mL三口烧瓶中，依次加入0.17 g(0.35 mmol)[Ru(phen)2]Cl2[17]，0.33 g(0.33 mmol)化合物L和50 mL甲醇，氮气保护下，回流反应24 h，反应结束后，向其中加入KPF60.92 g(5 mmol) 继续反应4 h，反应液经减压蒸馏除去甲醇得固体，然后用15 mL二氯甲烷溶解，减压抽滤得滤液，无水MgSO4干燥过夜，所得粗产物经硅胶柱层析分离，洗脱溶剂为二氯甲烷/甲醇(V/V=50/1)混合溶剂，得红色固体0.15 g，产率：41.6%。

配合物LRu的合成路线见图1。

图1 配合物LRu的合成路线Fig.1 Synthesis routes of complex LRu

IR(KBr,cm-1):3451,2929,1611,1481,1456,1427,14906,1365,1250,1177,838,739,720,557。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)：δ:14.16(s,1 H),9.05(t,J=8.6 Hz,2 H),8.78(d,J=8.2 Hz,4 H),8.40(s,4 H),8.25(d,J=8.7 Hz,2 H),8.17～8.05(m,4 H),8.01(d,J=5.2 Hz,2 H),7.87～7.72(m,6 H),7.23(d,J=8.8 Hz,2 H),4.10(t,J=6.5 Hz,2 H),1.82～1.70(m,2 H),1.57～1.40(m,2 H),0.97(t,J=7.4 Hz,3 H)。13C NMR(101 MHz,d6-DMSO)：δ:161.03,153.44,147.53,137.28,130.92,128.29,126.64,115.70,88.22,68.08,31.02,19.05,14.07。HR-MS:计算值:829.9300,测得值：829.0815 [M-2PF6]+。

1.3 细胞毒性测试与细胞染色

1.3.1 细胞毒性测试将人宫颈癌细胞(Hela)接种于96孔板上，在37 ℃和5%CO2条件下培养，当细胞密度长至85%左右时，向孔中加入配合物LRu，使其最终浓度分别为5、10、15、20、25 μmol/L，每组浓度设三个平行实验，同时设置对照孔和调零孔。当配合物LRu与Hela共孵育24 h后，每孔加入20 μL 的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐溶液(MTT)(5 mg/mL)，继续培养4 h，除去96孔板中的培养基(DMEM)，并加入100 μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪测量波长490 nm处各孔的吸光度。

1.3.2 细胞染色将人宫颈癌细胞(Hela)接种于共聚焦培养皿上，在37 ℃和5%CO2条件下培养，当细胞密度长至65%左右时，进行以下两组实验：(1)配合物LRu与Hela细胞共孵育20 min；(2)首先移除培养皿中的DMEM，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤2次，然后加入1.5 mL 4%多聚甲醛培养15 min，用PBS洗涤2次，最后加入2 mL含有配合物LRu(10 μmol/L)的DMEM，继续培养20 min。孵化好的Hela细胞用PBS洗涤3次，直接用于显影。

2 结果与讨论

2.1 配合物LRu的线性光学性质

选取苯、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)和水7种不同极性的溶剂，研究溶剂对配合物LRu吸收光谱和荧光光谱的影响。图2A是配合物LRu在不同极性溶剂中的紫外-可见吸收光谱图。配合物LRu在不同极性溶剂中的吸收峰位置几乎不随溶剂极性的变化而变化，只是吸收峰的强度略有差别。配合物LRu在不同极性溶剂中的最大吸收峰位于460 nm左右，可归属于配体到金属的跃迁(LMCT)。为了更好的理解吸收光谱和电子结构之间的关系，利用密度泛函理论(TD -DFT/B3LYP)对配合物LRu的跃迁过程进行计算，采用Gaussian 09程序，6-31G基组对C、H、N、O原子及LANL2DZ基组对Ru原子。图3和表1是配合物LRu的分子轨道能级图和理论计算的相关数据。由图3和表1可知，理论计算出的配合物LRu最大吸收峰在458 nm左右，是最高占有分子轨道(HOMO)到最低未占分子轨道(LUMO)的跃迁，其中HOMO轨道上的电子云主要分布在配体L上，LUMO轨道上的电子云主要分布在中心金属Ru原子和配体邻菲啰啉上，可归属于配体到金属的跃迁混有配体到配体的跃迁。理论计算出的最大吸收峰位置与实验测得的结果相符合，为解释配合物LRu的紫外-可见吸收光谱提供了理论依据。

表1 配合物LRu的理论计算相关数据

图3 配合物LRu的分子轨道能级图Fig.3 Molecular orbital energy diagram for LRu

图2B是配合物LRu在不同极性溶剂中的荧光光谱图。配合物LRu的测试浓度为10 μmol/L，荧光光谱的测试条件为激发波长460 nm,狭缝宽度为10.0 nm，电压为500 V。配合物LRu的最大发射峰在602 nm左右，斯托克斯位移为142 nm，且其发射峰位置随溶剂极性的增加变化不明显。以[Ru(bpy)2]Cl2(在乙腈溶液中的量子产率φ=0.062)为参比[19]，根据量子产率公式[20]计算得到配合物LRu在不同溶剂的中的量子产率分别为0.13(苯)、0.12(四氢呋喃)、0.10(乙酸乙酯)、0.04(乙醇)、0.10(乙腈)、0.36(二甲基亚砜)和0.35(水)。而且配合物LRu在DMSO和水溶液中的荧光强度比其他溶剂的强，以乙醇为例，LRu在水中的荧光强度约是其在乙醇中的8倍。在365 nm紫外灯照射下，配合物LRu在纯乙醇(0%)中呈现出微弱的红光，在水(99%)中呈现出明亮的红色荧光，且在固体状态下，LRu也发出明亮的红色荧光，造成这一现象的原因可能是聚集诱导荧光增强。

图2 配合物LRu(10 μmol/L)在不同溶剂中的紫外-可见吸收光谱(A)和荧光光谱(B)Fig.2 UV-Vis absorption spectra(A) and fluorescence spectra of complex LRu (c=10 μmol/L) in different solvents

此外，还探究了配合物LRu在PBS中的稳定性。在相同的测试条件下，时间间隔为2 h，测试配合物LRu的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，从图4中可以看出随着时间的延长，配合物LRu的吸收峰位置和荧光强度没有发生明显的变化，说明配合物LRu具有好的稳定性，可将其应用于生物体内。

图4 在不同的时间节点配合物LRu在PBS中的紫外-可见吸收光谱(A)和荧光光谱(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectra(A) and fluorescence spectra (B) of LRu (c=10 μmol/L) in PBS under different time

2.2 聚集诱导荧光性质

选择乙醇作为配合物LRu的良性溶剂，水作为不良溶剂，配制成不同含水量(fw=0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、99%)的混合溶液，测试配合物LRu的荧光光谱，配合物LRu的测试浓度为10 μmol/L。如图5所示，随着水含量的增加，配合物LRu的荧光强度逐渐增强。当fw=80%时，配合物LRu的荧光强度达到最大，比纯乙醇增强约6.7倍，这是典型的聚集诱导荧光增强性质，且荧光发射峰位置由590 nm红移到602 nm。这是由于水分子的加入，降低了配合物的溶解性，使其聚集成颗粒，在聚集状态下，配合物中单键的自由旋转受到限制，抑制了激发态的非辐射跃迁，最终导致配合物的荧光强度增强[7,21]。

图5 (A) 配合物LRu在不同体积比乙醇/水混合溶液中的荧光光谱图；(B) 配合物LRu的荧光强度与水体积分数的关系Fig.5 (A) Fluorescence spectra of complex LRu in ethanol/H2O mixtures with different water fraction；(B) The changes of fluorescence peak intensity of complex LRu with different water fractions

2.3 细胞毒性测试和细胞显影

首先利用MTT方法测试了配合物LRu的细胞毒性(图6)，当配合物LRu与Hela细胞作用24 h，细胞的存活率在80%以上，说明配合物LRu具有较低的细胞毒性，可将其安全地应用于活细胞成像。为进一步研究配合物LRu在细胞内的分布情况，利用Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜对配合物LRu进行细胞成像研究。

图6 配合物LRu与Hela细胞作用24 h后的细胞存活率Fig.6 Cell viabilities of Hela cells incubated with complex LRu for 24 h

将Hela细胞与10 μmol/L LRu共孵育20 min，如图7所示，在细胞周围观察到强的红色荧光信号，通过与明场图叠加，发现荧光信号主要来源于细胞的细胞膜区域。同时研究了配合物LRu在不同焦平面下的细胞成像实验，如图8所示，LRu在不同焦距下的荧光信号也主要来源于细胞膜区域。当用4%多聚甲醛固定Hela细胞后(图7)，发现配合物LRu主要着色于细胞的细胞质部位。说明配合物LRu可靶向在活细胞的细胞膜部位。

图7 配合物LRu在活细胞和固定的Hela细胞中的细胞成像图Fig.7 Cell images of live and fixed Hela cells incubated with LRu

图8 (A)在不同焦平面下配合物LRu孵育Hela细胞20 min后的共聚焦成像图；(B) 配合物LRu在Hela细胞中的3D成像图Fig.8 Confocal images of Hela cells incubated with LRu for 20 min under different focal lengths；(B) 3D imaging of LRu in Hela cells

高的光稳定性有利于化合物长时间进行细胞成像进而追踪细胞生理状态的变化过程。配合物LRu的光稳定性测试如图9所示，用激光不间断的扫描配合物LRu孵育的Hela细胞760 s，LRu的荧光强度在80%以上，说明配合物LRu具有比较好的光稳定性。与文献已报道的材料相比[22 - 25]，配合物LRu具有较好的光稳定性、生物相容性、大的斯托克斯位移和较高的量子产率，且能靶向在活细胞的细胞膜部位。但其自身也存在一些不足，如配合物LRu的最大发射峰在602 nm左右，发射波长较短。

图9 配合物LRu在细胞中的光稳定性Fig.9 Photostability of LRu in cell imaging

3 结论

设计合成了一种新型的邻菲啰啉钌配合物LRu，借助紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、理论计算、MTT测试和共聚焦显微成像系统地研究了配合物的光物理性质及细胞成像。研究结果表明：(1)在不同体积比的乙醇和水混合溶液中，配合物LRu展现出明显的聚集诱导荧光增强性质，发射波长在602 nm左右，且当含水量达到80%时，荧光强度增强约6.7倍；(2)配合物LRu具有较高的细胞存活率和高的光稳定性，可靶向活细胞的细胞膜部位。该研究结果为后期设计具有聚集诱导发红光性质的钌配合物提供了实验基础和设计思路。