基于石墨烯-金纳米粒子复合材料的黄芩苷电化学传感器的构建及应用

2021-07-14史艳梅张俊霞李秀敏苗明三

分析科学学报 2021年3期

史艳梅，张茜，张俊霞，李秀敏，苗明三*

(1.河南中医药大学中医药科学院，河南郑州 450001；2.纽约医学院微生物和免疫学系，美国纽约 10595)

黄芩是唇形科植物黄芩的干燥根，其药用价值广泛，为临床常用中药之一。黄芩苷(Baicalin，BA)作为中药黄芩的主要活性成分，具有抗炎[1]、抗过敏[2]、抗菌[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]的药理作用。市场上含黄芩的中药制剂种类繁多，而BA常被作为标志物用于药物的质量控制，所以建立快速灵敏的BA检测方法具有重要意义。目前，BA常用的检测方法有高效液相色谱法[6]、紫外分光光度法[7]、液-质联用法[8]和电化学方法[9]等。其中，电化学方法因具有仪器操作简单、快速、灵敏度高等优点而备受关注[10]。众所周知，电化学传感器的优良性能取决于提高传感材料的电活性面积及电子传输能力。因此，构建高电活性的纳米传感复合材料在电化学分析中具有重要意义。

还原氧化石墨烯(rGO)是一种优良的二维蜂窝状纳米材料，碳原子sp2的杂化方式使其具有独特的片层结构从而具有较大的比表面积[10]，广泛应用于电化学领域。然而rGO在制备过程中会产生一些结构缺陷，影响其导电性能[11]。金纳米粒子(Au NPs)具有导电性好和比表面积大的优势，结合在rGO表面后通过协同作用可进一步增强纳米复合材料的比表面积及电子转移速率，同时可以有效防止rGO片层间的聚集，提高rGO材料的电化学检测性能[12]。本研究利用原位还原法制备了Au NPs@rGO纳米复合材料，并应用于构建BA电化学传感器。对实验条件进行了优化，并对BA的电化学反应机理进行了分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；三电极系统：工作电极为玻碳电极(GCE，Φ=3 mm)或修饰GCE，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极；高效液相色谱仪(Waters 2695);电子分析天平(ME204，Mettler Toledo)； pHS -3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；ELGA Centra R200超纯水机(UK)。

黄芩苷(BA)(≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津光复科技有限公司)；柠檬酸钠、KCl、KH2PO4、Na2HPO4(天津科密欧化学试剂有限公司)；Nafion溶液(Nafion D -520分散液，阿法埃莎化学有限公司)；石墨粉(≥325目，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；HAuCl4·3H2O(ACROS公司)。实验所用试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

双黄连口服液(河南太龙药业股份有限公司)。

1.2 Au NPs@rGO纳米复合材料的制备

采用Hummers法以石墨粉为原料制备氧化石墨烯(GO)[13]。取25 mL 4.0 mg/mL的GO悬浮液，超声分散，在搅拌下加入200 μL 1%的HAuCl4并加热至80 ℃，逐滴加入1.2 mL 80%的水合肼溶液，80 ℃下加热回流2 h，8 000 r/min离心，水洗3次，重新分散在25 mL水中即得到Au NPs@rGO复合物。取5 mL Au NPs@rGO与0.5%Nafion溶液(1∶1)混合，即得修饰电极的纳米复合材料AuNPs@rGO。

1.3 修饰电极的制备

分别用0.3、0.05 μm的Al2O3抛光粉将GCE表面打磨至镜面状，依次用乙醇和水各超声清洗1 min，晾干后，吸取5 μL Au NPs@rGO -Nafion分散液滴涂在GCE表面，红外灯下干燥后，即可得到修饰电极Au NPs@rGO -Nafion/GCE。

1.4 电化学检测

在含有BA的0.25 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.0)中，采用三电极工作体系，在搅拌作用下富集3 min，然后在-0.2～0.7 V范围内进行扫描，利用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行测量。测量结束后，用水冲洗电极，随后在空白PBS中扫描更新电极表面。所有测量均在室温下进行。

2 结果和讨论

2.1 Au NPs@rGO复合材料的表征

利用扫描电镜(SEM)对Au NPs@rGO复合材料形貌进行分析。如图1所示，电极表面具有众多褶皱，显著增大了电极的比表面积，同时看到Au NPs均匀的分布在rGO表面，表明Au NPs@rGO复合材料构建成功。

图1 Au NPs@rGO复合材料的扫描电子显微镜(SEM)照片Fig.1 SEM image of Au NPs@rGO composite material

2.2 Au NPs@rGO -Nafion/GCE的电化学表征

为了评价Au NPs@rGO -Nafion/GCE的电化学性能，以[Fe(CN)6]3-/4-溶液作为探针，进行循环伏安(CV)扫描。由图2可知，裸GCE上有一对典型的氧化还原峰，峰电位差为73 mV，接近理论值69 mV，说明电极状态良好，适用于制备修饰电极。在rGO -Nafion/GCE上进行测定时，探针响应峰电流及背景电流明显增加；且在Au NPs@rGO-Nafion/GCE上时，响应峰电流及背景电流进一步显著提升，推测可能是由于Au NPs@rGO复合材料显著提高了电极比表面积，进而增加了反应的活性位点致使其电化学信号显著增强。为了更好地阐释复合材料Au NPs-@rGO对电活性比表面积的影响，利用CV法对其进行了探究，根据Randles-Sevcik公式[14]可计算出Au NPs@rGO -Nafion/GCE和GCE的电活性比表面积分别为0.229 cm2和0.117 cm2。

图2 GCE(a)、rGO -Nafion/GCE(b) 和Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c)在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循环伏安(CV)图Fig.2 CVs of bare GCE(a),rGO -Nafion/GCE(b) and Au NPs@rGO -Nafion/GCE(c) in [Fe(CN)6]3-/4-solutionscan rate:125 mV/s.

2.3 BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的电化学行为

图3(A)分别为GCE、rGO -Nafion/GCE、Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA中，在125 mV/s扫速下的CV曲线。GCE在0.177 V处出现一个弱的氧化峰，说明裸GCE的吸附能力较弱，电化学反应较慢；在rGO -Nafion/GCE上出现一对典型的氧化还原峰，且响应电流明显增加；而在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上，响应电流进一步增强，说明由于Au NPs@rGO纳米复合材料大的比表面积和良好的导电能力，增强了BA的电化学反应性能。为了研究反应动力学，考察了BA在不同扫描速度下的电化学行为。如图3(B)所示，随着扫速的增加，响应电流也逐渐增加。在扫描速率在0.025～0.3 V/s的范围内，峰值电流与扫描速度之间呈良好的线性关系(图3(C))，推断BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上是吸附控制的过程。同时，由图3(B)可知响应峰电位随扫速的变化也随之变化，其氧化峰电位(Epa)与扫描速率的对数(lnv)线性关系良好(图3(D))，根据Laviron理论[15]，可计算出BA的电子传递数n为2.2≈2，α值是0.69。采用计时电量法(Q-t)评估BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的饱和吸附量。图3(E)为Au NPs@-rGO -Nafion/GCE在5 μmol/L BA溶液(a)及PBS空白溶液(b)中的Q-t曲线，对应的Q-t1/2曲线展示在图3(F)中。如图3(F)所示，曲线a和b的斜率几乎相等，进一步证明了该电化学反应是吸附控制的过程。根据公式:Q=nFAΓ*计算，BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的饱和吸附量(Γ*)为3.8×10-9mol/cm2。

图3 (A)不同电极在BA溶液中的CV图；(B)BA在不同扫描速率下的CV图(a→l：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3 V/s)；(C)电流和扫描速率之间的校正曲线；(D)Epa和lnv之间的校正曲线；(E)Au NPs@rGO -Nafion/GCE在BA溶液(a)和空白溶液(b)中的计时电量曲线(Q-t)；(F)Q和t1/2之间的校正曲线Fig.3 (A) CVs of different electrodes in baicalin solution;(B) CVs of baicalin at different scan rates(a→l:0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.175,0.2,0.225,0.25,0.275,0.3 V/s);(C) Calibration curve between oxidized current and scan rate;(D) Calibration curve between Epa and lnv;(E) Chronocoulometric curve(Q -t) of Au NPs@rGO -Nafion/GCE in baicalin solution(curve a) and blank solution(curve b);(F) Calibration curve between Q and t1/2

2.4 实验条件的优化

2.4.1 底液pH值和浓度的影响在5 μmol/L BA溶液中，对支持电解质PBS的pH值(2.0～9.0)和浓度(0.1～0.35 mol/L)进行了优化。如图4(A)所示，pH=7.0时峰电流达到最大值，随后开始减小，因此选择7.0作为测定BA的最佳pH值。同时发现，随pH增大，响应峰电位向负电位方向移动，说明有质子参与该电极反应[16]。由图4(B)可知Epa与pH之间存在线性关系，回归方程为：Epa=-0.0537pH+0.5821，R2=0.9922。方程的斜率与理论值0.059 V/pH相近，说明BA在修饰电极上是等质子等电子的过程，鉴于计算所得电子转移数为2，可知两个质子两个电子参与了BA的电化学反应。如图4(B)所示，PBS浓度在0.1～0.25 mol/L范围内，BA氧化峰电流随PBS浓度的增大而增大，而后继续增加其浓度，响应电流反而减小，故PBS的最佳浓度设定为0.25 mol/L。

2.4.2 富集时间的影响在吸附控制的电化学反应中，富集时间是影响检测灵敏度的又一重要参数。考察了富集时间对5 μmol/L BA氧化峰电流的影响，结果如图4(C)所示，随富集时间增加，响应电流逐渐增大，至180 s时，吸附量趋于饱和，之后变化缓慢，选择180 s为最佳的富集时间。

图4 (A)pH对响应电流的影响；(B) PBS浓度对响应电流的影响；(C) 富集时间对响应电流的影响Fig.4 (A)Effect of pH on response current;(B) Effect of PBS concentration on response current;(C) Effect of enrichment time on response current

2.5 标准曲线及检出限

在最佳实验条件下，利用差分脉冲伏安法(DPV)研究了不同浓度BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上的电化学响应。图5可以观察到峰电流随着BA浓度的增大而增加，在0.05～10 μmol/L范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为：Ipa=-18.953c-6.8269，R2为0.9961，检出限(S/N=3)为0.01 μmol/L。说明BA在Au NPs@rGO -Nafion/GCE上具有较高灵敏度。

图5 不同浓度BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L)在PBS(pH=7.0中的DPV图(插图是BA浓度与电流之间的校正曲线)Fig.5 DPV of different concentration of BA(a→h:0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L) in PBS buffer (pH=7.0)(The insert was the calibration plot between current and BA concentration)

2.6 重现性、稳定性和干扰实验

按照上述制备方法，平行制备5根修饰电极，在最佳条件下放入2 μmol/L的BA溶液中依次测定，结果显示，传感器相对标准偏差为3.53%，具有良好的重现性。将使用过的修饰电极，在冰箱中放置7 d后再次进行测量，响应电流值为初始电流的92.20%，具有较好的稳定性。

在最佳实验条件下，评估了几种可能的干扰物对电极检测能力的影响。当BA浓度为2 μmol/L，在允许相对误差为5%时，300倍Ca2+、Mg2+、Zn2+，100倍尿酸，50倍的多巴胺、抗坏血酸对BA信号无影响。说明该方法具有良好的选择性，可以应用于实际检测中。

2.7 实际样品的测定

利用所建立的方法，对双黄连口服液中BA含量进行测定。分析前取适量的双黄连口服液，用pH为7.0的0.25 mol/L的PBS稀释50倍，0.22 μm滤膜过滤后进行电化学测定，计算得到稀释后口服液中BA的含量为2.78 μmol/L。进一步在该待测液中进行BA加标回收实验，其回收率在99.60%～105.3%之间，RSD低于3.12%。为了验证该传感器的准确性，利用HPLC法对双黄连口服液中BA的浓度进行检测。色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：0.6%冰HAc(A相)，乙腈(B相)；洗脱条件：0～4 min，15%→18%B；4～10 min，18%→25%B；10～20 min，25%→30%B；流速：1.0 mL/min；检测波长为300 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。测得实际样品中BA的含量为2.65 μmol/L，RSD为1.89%。电化学方法与HPLC法所得结果相吻合，证明所制备的Au NPs@rGO -Nafion/GCE对实际样品的测定具有较高的准确度。