肿瘤成纤维细胞通过外泌体 miR- 21促进膀胱癌细胞侵袭转移

魏勇， 陈鹏， 朱洪儒， 陈全兵， 姜亚志， 钱文晖

(1. 南京市高淳人民医院泌尿外科，江苏 南京 211300； 2. 南京中医药大学附属医院泌尿外科，江苏 南京 210029)

膀胱癌是全球第九大常见的恶性肿瘤，每年约有43万新发病例，16万人死于该疾病[1]。在中国，膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤之一[2]。由于膀胱癌的早期症状并不典型，很多患者在出现血尿、膀胱刺激征等症状就诊时，肿瘤细胞已经浸润膀胱肌层或者出现远处转移，导致膀胱癌患者预后较差。而早期膀胱癌患者的预后明显好于晚期患者[3]。因此，对膀胱癌侵袭、转移的分子机制的研究将为膀胱癌发生、诊治和提高生存率提供理论依据。近期越来越多的研究显示，肿瘤间质在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用[4]。作为肿瘤基质中的主要成分之一，肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast, CAF)在胃癌、胰腺癌、肝癌等中具有促进肿瘤发生发展的作用[5-7]。然而有关CAF在膀胱癌发生发展中的作用报道仍较少。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 组织标本、细胞株 共收集34例于2015年1月—2018年12月在南京市高淳人民医院行膀胱癌切除术患者的膀胱癌组织及对应癌旁组织标本。手术切除所得标本放置于液氮中直至进一步分析。所有标本均经本院病理科确诊为膀胱癌，其中非浸润性膀胱癌15例，浸润性膀胱癌19例。所有患者在手术前均签署了知情同意书，同意收集组织标本用于科学研究。利用组织块贴壁法，分别从浸润性膀胱癌和癌旁组织中提取CAF和正常成纤维细胞(normal fibroblasts, NF)。膀胱癌T24细胞购自上海中国科学院。

1.2 细胞培养及转染

CAF、NF及膀胱癌T24细胞的常规培养用含有10%胎牛血清和抗生素(100 U/mL青霉素G和100 mg/mL链霉素)的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

细胞共培养时，将T24细胞按4×104/孔铺于24孔板，按1 ∶1比例，取传代3代后的CAF或NF种植于Transwell小室内，形成小室上层为CAF/NF细胞，下层为 T24细胞的共培养体系，共培养48 h后取T24细胞进行后续实验。

1.3 外泌体提取及鉴定

采用外泌体提取试剂盒，在无菌条件下，提取CAF及NF分泌的外泌体。CAF及NF细胞以每孔5×105铺于6孔板中，培养48 h后收集培养液，1500×g离心20 min，去除细胞碎片。吸取上清液按1 ∶4的比例加入ExoQuick 试剂，混匀后4 ℃孵育60 min后，1 500×g离心30 min，得到外泌体，加入200 μL无菌的PBS 重悬外泌体，并放入-80 ℃冰箱保存。取10 μL外泌体悬液滴加在载样铜网上，静置10 min后用2%磷钨酸滴染色2 min，随后在JEM-1010透射电镜下观察外泌体并拍照。

1.4 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测 相对表达量

1.5 免疫荧光观察成纤维细胞中α-SMA的表达

将传代3代以后的CAF及NF细胞培养72 h后，利用4%甲醛溶液固定20 min，0.3% Triton X-100 渗透 10 min，室温封闭30 min，一抗α-SMA(1 ∶1 000配置)4 ℃孵育过夜。加入荧光标记二抗孵育30 min，避光。封片，荧光显微镜下观察。

1.6 Transwell实验观察CAF、外泌体及 对T24细胞侵袭、迁移的影响

1.7 蛋白质印迹检测T24细胞中PTEN蛋白表达及外泌体表面标志CD9、CD63

检测外泌体表面标志CD9、CD63蛋白时，利用RIPA裂解液抽提外泌体蛋白，余步骤同上，兔抗人CD9和CD63抗体按1 ∶1 000配置。

1.8 荧光素酶实验

1.9 统计分析

2 结果

A：qRT-PCR检测膀胱癌组织中 miR- 21的表达；B：免疫荧光观察CAF中α-SMA表达(×400倍)；C：qRT-PCR检测CAF中 miR- 21的表达

2.2 CAF可促进膀胱癌细胞侵袭迁移

将CAF或者NF与膀胱癌T24细胞共培养48 h后，Transwell侵袭迁移实验结果显示，相较于与NF共培养的T24细胞，与CAF共培养的T24细胞的侵袭、迁移能力更强(图2)。

图2 CAF促进膀胱癌T24细胞侵袭迁移(×100倍)

2.3 CAF通过外泌体释放 促进膀胱癌细胞侵袭转移

A：透射电镜观察外泌体形态(×80 000倍)；B：蛋白质印迹检测外泌体CD9、CD63的表达；C：qRT-PCR检测外泌体中 miR- 21的表达

A: CAF和NF外泌体孵育的T24细胞中 miR- 21的表达；B：分别与CAF和NF分泌的外泌体孵育的T24细胞的侵袭和迁移实验；C：转染阴性对照和 mimics的T24细胞的侵袭和迁移实验

图5 miR- 21可靶向抑制PTEN的表达

3 讨论

越来越多的研究显示肿瘤间质在肿瘤发生发展的过程中起着重要的作用[12]。CAF是肿瘤间质中含量最丰富的细胞之一，为肿瘤细胞提供支持性微环境，并诱导肿瘤细胞获得更具侵袭性的能力[13]。

关于CAF在不同类型肿瘤的发生发展过程中所起作用及机制已有文献报道。CAF可通过分泌细胞因子，如转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6等，提供促肿瘤信号，促进肿瘤血管生成、侵袭转移的发生[4]。但对于CAF在膀胱癌中的作用研究仍较少。Yang等[14]的研究揭示了CAF可通过释放IL1β增强膀胱癌T24细胞增殖及侵袭的能力。Miyake等[15]发现高表达CXCL1的CAF可明显提升膀胱癌细胞侵袭迁移的能力，并预示着较差的预后。Zhuang等[16]研究显示CAF可通过释放TGF-β引起膀胱癌细胞发生上皮间质转换，促进侵袭迁移的发生。

miRNA可通过靶向众多靶基因的3′-UTR来调节肿瘤细胞的发生和发展过程，这是一种重要的表观遗传调控机制。与此同时，miRNA可被细胞通过外泌体的形式释放到细胞外，被受体细胞接受，调控受体细胞相应的功能。因此外泌体miRNA可充当肿瘤细胞与间质细胞间相互沟通的信使，受到广泛关注[17]。目前尚无关于外泌体miRNA参与膀胱癌及CAF间相互作用的研究报道。