眼部成纤维细胞在眼科疾病中的研究进展△

2022-01-15项敏泓

眼科新进展 2021年12期

刘江文杭项敏泓

成纤维细胞也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织中最常见的细胞，在机体内广泛分布。成纤维细胞可合成、分泌大量的细胞外基质(ECM)，促进伤口愈合，参与纤维化疾病的发生[1]。皮肤成纤维细胞参与受损皮肤的修复，促进伤口愈合及瘢痕形成[2]；肺部成纤维细胞产生的大量ECM沉积可引发特发性肺纤维化[3]；心肌成纤维细胞参与心肌细胞的重塑并导致不同程度的心功能衰竭[4]；肝脏成纤维细胞的增殖和活化会导致肝纤维化[5]等。同样，眼部成纤维细胞在眼科的诸多疾病中起着重要的作用。本文就眼部成纤维细胞的生物学特征、体外培养的方法及其在眼科疾病中的研究进展作一综述，以期指导临床。

1 成纤维细胞的生物学特征

成纤维细胞形态多样，主要有梭形、鹿角形和星形，胞核呈椭圆形，核仁大而明显；胞质呈弱嗜碱性，含丰富且发达的粗面内质网、高尔基复合体及游离核糖体，因此具有强大的合成和分泌蛋白质的功能。此外，成纤维细胞还具备合成胶原纤维蛋白、粘连蛋白以及分泌胶原纤维、弹力纤维和网状纤维的能力。当成纤维细胞处于低活性状态时，称之为纤维细胞。纤维细胞的胞体较小，呈长梭形，细胞质少[6]。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞重新转变为成纤维细胞，其合成和分泌蛋白质的功能也随之恢复。在转化生长因子-β1(TGF-β1)的诱导下成纤维细胞可进一步转化为肌成纤维细胞，其可改变原有的组织张力，参与组织损伤后的修复[7]。

2 眼部成纤维细胞的培养方法

2.1 结膜松弛症成纤维细胞将结膜松弛症患者手术中切除的松弛结膜组织放入无菌生理盐水中漂洗去除血污，剪成 0.5 mm×1.0 mm×1.0 mm大小的组织块，平铺于六孔板并置于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中，待组织块接近干燥后再缓慢贴壁加入3 mL含体积分数10%胎牛血清和1 g·L-1青链霉素及成纤维细胞生长添加物的DMEM培养液，每3 d换液1次，2～5 d可见贴壁组织块周围有细胞溢出。经形态学观察、免疫荧光染色及流式细胞术等方法鉴定后，传至第3～5代的成纤维细胞可用于后续实验[8]。

2.2 翼状胬肉成纤维细胞将翼状胬肉患者手术中获得的组织块置于DMEM培养液中，使用含有500×103U·L-1青霉素和500 mg·L-1链霉素的磷酸盐(PBS)缓冲液对组织块进行漂洗，再将组织块剪成1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm大小，接种在涂有胎牛血清的培养皿中，加入培养基，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱过夜。每3～4 d换液1次。当细胞融合度达到70%～80%时将细胞转移至培养瓶中继续孵育，取第3～10代细胞进行后续实验[9]。刘琳琳等[10]使用斜口培养瓶对翼状胬肉成纤维细胞进行体外培养。无菌条件下将取得的翼状胬肉组织样本置于冰上，用PBS缓冲液冲洗后将组织块修剪为0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，加入含体积分数12%胎牛血清的培养液，2～3 d后可见长梭形细胞从组织块边缘爬出，1 周后可长满培养瓶，用胰蛋白酶消化后传代。每2 d换液1次，4～6 d可传代，取第3代细胞进行后续实验。

3 成纤维细胞在眼科疾病中的研究进展

3.1 成纤维细胞与结膜松弛症的相关研究结膜松弛症是由于球结膜过度松弛和(或)下睑缘张力过高造成松弛的球结膜堆积在眼球与下睑缘、内眦、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学微环境异常，并伴有眼部干涩、异物感、溢泪等不适症状的眼病[11]。结膜松弛症的发病机制目前尚未完全明确，可能涉及不同的因素，如结膜老化、泪膜不稳定、机械摩擦、泪液清除延迟等，其中结膜的胶原纤维溶解和弹力纤维变性是结膜松弛症的致病因素之一[12]。李轶捷等[13]通过透射电镜发现，结膜松弛症患者球结膜固有层及筋膜组织中的胶原纤维减少、成纤维细胞发生变性。Xiang等[14]研究发现，结膜松弛症患者松弛结膜组织中基质金属蛋白酶(MMP)-1和MMP-3表达上调。由于MMP可促进ECM降解，其上调意味着胶原纤维溶解和弹力纤维降解的活性增加，导致结膜基质和眼球筋膜过度降解，出现球结膜变薄，松弛结膜组织堆积并形成结膜松弛症。韩竹梅等[15]利用ELISA法检测到结膜松弛症患者成纤维细胞上清液中穿透素-3及肿瘤坏死因子-α刺激基因6的表达上调，证实炎症反应相关蛋白穿透素-3、肿瘤坏死因子-α刺激基因6参与结膜松弛症的发生发展。

严重的结膜松弛症患者需要手术治疗，但手术存在风险，且有一定适应证，因此更为安全的治疗手段显得尤为重要。研究发现，中药杞精明目汤可下调结膜松弛症患者成纤维细胞中 MMP-1、MMP-3的表达[16]。贾元玲等[17]采用杞精明目汤颗粒剂对体外培养的结膜松弛症患者结膜成纤维细胞进行干预，检测其丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白及mRNA的表达，证实杞精明目汤可下调该通路的表达，从而起到治疗结膜松弛症的作用。

3.2 成纤维细胞与翼状胬肉的相关研究眼部成纤维细胞参与翼状胬肉的发生发展过程，包括细胞的增殖、迁移、纤维化、炎症浸润、血管生成和ECM的分解[18]。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肌成纤维细胞中高表达，是成纤维细胞收缩的主要标志，可推动上皮细胞向间充质细胞转变[19]。TGF-β1是纤维化的主要诱导剂，促进肌成纤维细胞分化，并诱导上皮-间质转化[20]。研究发现，与正常结膜组织相比，翼状胬肉组织中TGF-β1、α-SMA表达增强，提示眼部成纤维细胞的纤维化参与翼状胬肉的发生发展[21]。在倒置显微镜下可见原代培养的正常人结膜成纤维细胞为典型树突状，而翼状胬肉患者成纤维细胞则失去原始形态，表现为更加扁平的细胞，且伴有α-SMA和TGF-β1表达显著升高[22]。彭娟等[23]发现，鼻、颞侧均有翼状胬肉的患者，其结膜成纤维细胞的增生、移行能力大于仅有单侧翼状胬肉和正常人的结膜成纤维细胞，且α-SMA的表达更强。

目前翼状胬肉的治疗以手术为主，传统的抗代谢药物如丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶等可抑制结膜下组织纤维化，减少疾病复发[24]，但可导致巩膜溶解、眼内炎、黄斑病变、低眼压等不良反应[25]，因此临床需要新的抗纤维化药物。Koga等[26]将翼状胬肉患者成纤维细胞用丁酸酯或苯丁酸酯处理48 h，通过实时荧光定量PCR检测α-SMA、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和MMP-1的表达，证实丁酸酯或苯丁酸具有抗纤维化的作用。Chen等[27]研究发现，迷迭香酸可下调I型胶原蛋白和TGF-β1/Smad的信号转导，从而抑制纤维化。Tao等[28]将体外培养的翼状胬肉患者成纤维细胞经200 g·L-1吡非尼酮处理后发现，其可有效抑制成纤维细胞的增殖、迁移和胶原蛋白的收缩，提示吡非尼酮可预防术后翼状胬肉的复发。

3.3 成纤维细胞与角膜疾病的相关研究眼部的感染、手术和创伤，都可能会触发原本透明的角膜组织中成纤维细胞的形成和进一步纤维化，从而使角膜失去透明性，甚至导致永久性的视力障碍。如碱烧伤可破坏角膜的完整性，诱导静止细胞分化为成纤维细胞或肌成纤维细胞并表达α-SMA，参与组织修复与瘢痕形成[29]。一项对持续性角膜上皮细胞缺损的研究表明，角膜瘢痕的形成是肌成纤维细胞介导的纤维化过程[30]。LASIK术后，患者角膜瓣边缘的窄带出现肌成纤维细胞的转化[31]，角膜基质层的纤维化总出现在LASIK患者的角膜瓣缘，这种纤维化有助于预防外伤所致的角膜瓣移位[32]。Luft等[33]对SMILE和飞秒激光辅助的LASIK(FS-LASIK)术后患者角膜基质层进行观察发现，FS-LASIK 术后患者激光损伤部位纤维连接蛋白的表达较SMILE强。由于纤维连接蛋白是由角膜基质层中活化的成纤维细胞所产生，提示成纤维细胞参与FS-LASIK术后角膜基质的纤维化反应。

3.4 成纤维细胞与青光眼滤过手术后的瘢痕化青光眼是目前主要的致盲性眼病之一，降低眼压是其主要的治疗手段[34]。青光眼滤过性手术可有效降低眼压，但术后患者可能出现滤过道的瘢痕化，成纤维细胞的增生和ECM的过度合成是滤过泡瘢痕形成的主要原因[35]。滤过性手术可激活Tenon囊的成纤维细胞(HTFs)，HTFs的激活导致纤维化蛋白的产生和过度增生，进一步引起滤过泡中过多的瘢痕形成[36]。研究发现，青光眼患者的房水中存在较高生物活性的TGF-β1，使青光眼患者小梁网中ECM沉积和纤维化加重[37]。青光眼术后滤过道的瘢痕中还存在细胞表型的转化，表现为HTFs转化为肌成纤维细胞[38]。晏维玲等[39]发现，在HTFs转化为肌成纤维细胞的过程中，P53表达显著升高，miR-29b表达明显降低，推测P53与miR-29b之间的相互作用可调控瘢痕纤维化过程。邰雪等[40]研究发现，雷帕霉素可抑制兔抗青光眼术后滤过区组织的过度增生，保留功能性滤过泡，并诱导兔眼结膜成纤维细胞的凋亡，抑制青光眼患眼术后成纤维细胞的过度增生，预防瘢痕化的发生。

3.5 成纤维细胞与视网膜疾病的相关研究在诸多视网膜疾病中可见成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，例如增生性玻璃体视网膜病变(PVR)和年龄相关性黄斑变性(AMD)患者视网膜下发生纤维化[41]。

PVR是一种纤维化改变的病理过程，视网膜下膜或视网膜前膜的形成是PVR的主要特征。成纤维细胞和肌成纤维细胞被认为是视网膜前膜的主要细胞表型，其一旦收缩将会对视网膜形成广泛的牵拉作用，导致视网膜皱缩和牵拉性视网膜脱离[42]。Shu等[43]认为这与肌成纤维细胞中α-SMA的表达增加有关，其可促使视网膜前膜中的肌成纤维细胞具有更持久的收缩特性，分泌更多的ECM和促纤维化因子，从而促使PVR膜收缩，最终导致不可逆的视力丧失。

新生血管向黄斑部的生长是AMD的标志性病理改变[44]，黄斑纤维化是AMD自然病程的终末期[45]。研究发现，AMD患者的脉络膜新生血管膜中存在多种细胞，包括成纤维细胞、内皮细胞、视网膜色素上皮细胞、巨噬细胞，且在脉络膜新生血管膜中检测到α-SMA阳性细胞，它是肌成纤维细胞的特征性标志。肌成纤维细胞产生大量的ECM参与黄斑的纤维化，是驱动病原性纤维化的关键细胞[46]。

3.6 成纤维细胞与眼睑基底细胞癌的相关研究在倒置显微镜下观察发现，与正常成纤维细胞相比，眼睑基底细胞癌患者成纤维细胞呈长梭形，细胞质突起减少，增生快速，排列不规则，可重叠生长，丧失了接触抑制现象，且成纤维细胞特异性表达α-SMA、活化蛋白、波形蛋白等[47]。成纤维细胞活化蛋白是成纤维细胞活化后特异性表达的标志物，其在眼睑基底细胞癌患者成纤维细胞中过表达，并通过调节 PTEN/PI3K/Akt 信号通路促进癌相关成纤维细胞的增殖，提示基底细胞癌患者成纤维细胞的迁移、侵袭与眼睑基底细胞癌的发生密切相关[48]。

3.7 成纤维细胞与Graves眼病的相关研究Graves眼病是一种以炎症、组织重塑、扩张和纤维化为特征的自身免疫性疾病[49]。研究证实，Graves眼病眼眶成纤维细胞中结缔组织生长因子表达升高，其可直接或充当TGF-β1的下游介质来促进Graves眼病患者眼眶成纤维细胞转化为肌成纤维细胞并产生ECM[50]。活化的眼眶成纤维细胞产生炎症介质，这些炎症介质又可促进肌成纤维细胞的分化，并刺激富含透明质酸的基质积聚，加剧眼眶组织的水肿和纤维化[51]。Graves眼病晚期，患者眼眶组织的纤维化会导致眼球运动受限、眼球突出，出现暴露性角膜炎和甲亢相关的视神经病变等[52]。