灵芝多糖对HepG2细胞诱导的肝癌小鼠肠道菌群及其菌群代谢功能的调节作用*

于 雷，孙 超，张曼旭

人类各种疾病，包括各种代谢性疾病、肠道疾病、癌症和自身免疫性疾病等均与肠道微生物失调紧密相关，其中肝脏疾病的关联性尤为显著[1]。很多学者[2，3]研究发现肝细胞癌、肝硬化和非酒精性脂肪性肝病等患者体内存在肠道菌种及其代谢的紊乱状态。肝癌作为临床上高发性恶性肿瘤之一，不仅严重影响人类的生存质量和生命健康，同时对社会和家庭经济带来沉重的负担[4]。近几年来，很多中医药研究机构试图尝试研发辅助药物以帮助治疗肝癌患者，例如灵芝三萜和加味柴苓汤等[5，6]。灵芝多糖(ganoderma lucidum plysaceharide，GLP)是从灵芝中提取的一种主要活性组分。药理学研究揭示GLP在调节免疫功能、抗癌、抗氧化、抗衰老和抗辐射等方面起着至关重要的作用[7]。以往研究[8]主要围绕GLP对肝癌小鼠肠道粘膜免疫功能的影响或肝癌细胞增殖和迁移的影响等。本研究采用HepG2细胞构建小鼠肝癌模型，并初步探讨了GLP对其肠道菌群及其菌群代谢功能的调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞、药品和试剂 SPF级昆明小鼠，体质量为(17.5±2.2)g，购自武汉大学实验动物资源中心(动物合格证号为16054418)。饲养在24～26℃，相对湿度为53～55%的室内，通风换气10次/h，光照12 h，黑暗12 h，自由获取食物和水；HepG2肝癌细胞株由中国医学科学院肿瘤细胞库提供。培养方法：从液氮罐中取出HepG2细胞、复苏，用DMEM(含10%胎牛血清)培养基，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，待细胞呈对数生长期时终止培养，1200 r/m离心10 min，弃去上清液，再用DMEM(含10%胎牛血清)重悬细胞，制成2×105个/mL的细胞悬液，备用；GLP由西安明泽生物科技股份有限公司提供。益生菌由辉凌公司提供，用前稀释至50%浓度。精提基因组DNA裂解液：50 mmol/L Tris-HCL、50 mmol/L EDTA、500 mmol/L NaCl、4% EDTA，将pH调至8.0。应用上下游引物(上海生物工程公司)扩增细菌16 s rRNA V3可变区。

1.2 肝癌小鼠模型的建立 用注射器取上述HepG2细胞悬液200μL，注射至小鼠右腋下部位，密切观察小鼠皮下成瘤情况。当出现可见瘤体时，表示造模初步成功。然后，每周测量肿瘤结节直径。当达到1cm时，表示造模成功，用于后续实验。本次总共成功构建肝癌模型小鼠21只。

1.3干预与分组 将上述造模成功的肝癌小鼠随机分为模型组、GLP组和益生菌组，每组7只。另随机选择7只正常小鼠作为对照组。GLP和益生菌用量参照临床上成人的用药剂量，采取人体-小鼠体表面积比值折算后应用2倍量，灌胃；在模型组和对照组，给予等量的生理盐水，灌胃，1次/d，连续干预2 w。

1.4 小鼠肠道菌群组成结构检测 镜检法：采用颈椎或尾椎脱臼法处死小鼠，剥离皮下肿瘤组织，分离小肠，严格按照无菌操作取出一定量的肠道内容物，于含有玻璃珠和灭菌蒸馏水的三角瓶内，于摇床上120 r/m震荡30 min，以利于各类微生物充分分散。采用混菌法和涂布法将上述菌液以适宜的稀释比例接种于相应培养基，置于37℃培养箱培养24～48 h。取出培养液，于显微镜下观察，计数肠道内容物的菌群丰度。以每克肠道内容物含特定类型细菌数表示，每个稀释度重复检测3次；变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)：取小鼠粪便，置于干净的2 mL无菌EP管中，添加一定量的镐珠，加入精提基因组DNA裂解液700μL，吹打、充分混匀，再将苯酚/氯仿/异戊醇以25/24/1比例加入250μL并混匀。在旋涡震荡仪上震荡3 min，12000 r/m离心5 min，取上清于新的无菌EP管中，加入10 mol/L乙酸铵700μL，冰上放置5 min，12000 r/m离心10 min，取上清并再次用苯酚/氯仿/异戊醇抽提2次，氯仿抽提2次，再加入异丙醇并置于-20℃冰箱30 min，使DNA沉淀。离心并弃掉上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，最后用双蒸水50μL溶解DNA，备用；PCR扩增16 s rRNA V3可变区。PCR反应体系：Taq DNA聚合酶12.5μL、10μM F 0.5μL、10μM R 0.5μL、DNA模板1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应条件采用Touch down程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸70 s，共20个循环，每个循环退火温度依次降低0.5℃，温度递降范围为65～56℃，最后以56℃退火温度循环10次；配制浓度为8%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度范围为30%～58%。将上述DNA扩增产物上样，并置于1×TAE缓冲液中电泳，电泳条件：电压220 v，预电泳5 min，60℃、电压85 v电泳16 h；硝酸银染色、拍照，应用Quantity One软件分析；DGGE指纹图谱分析。应用相似性聚类分析法将DGGE胶通过扫描仪输入到电脑，再应用Molecular Analysis软件分析各细菌序列相似性，每一个条带表示特定菌种，然后通过序列比对分析和计算得出菌种丰富度、多样性指数和均匀度。

1.5 小鼠肠道菌群脂肪酸代谢产物检测 于干预后2 w收集各组小鼠粪便，采用气相色谱法检测短链脂肪酸(乙酸、丙酸、正丁酸)水平；采用Megazyme D-乳酸定量检测试剂盒测定D-乳酸含量。

2 结果

2.1 四组小鼠肠道菌群比较 GLP处理组和益生菌处理组小鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和肠球菌数量显著低于模型组(P<0.05)；模型组小鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和肠球菌数量显著高于对照组(P<0.05)；但GLP处理组和益生菌处理组小鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和肠球菌数量与对照组基本一致(P>0.05，表1)。

表1 四组小鼠肠道菌群比较

2.2 四组小鼠粪便DGGE图谱指标比较 GLP处理组和益生菌处理组小鼠肠道菌群丰富度、多样性指数和均匀度较显著高于模型组(P<0.05)；模型组小鼠肠道菌群丰富度、多样性指数和均匀度均显著低于对照组(P<0.05，表2)。

表2 四组小鼠粪便DGGE图谱指标比较

2.3 四组小鼠菌群代谢功能指标比较 GLP组、益生菌组小鼠肠道菌群代谢产物短链脂肪酸乙酸、丙酸、正丁酸均显著高于模型组(P<0.05)，D-乳酸显著低于模型组(P<0.05)；模型组乙酸、丙酸、正丁酸均显著低于对照组(P<0.05)，D-乳酸显著高于对照组(P<0.05)；GLP组、益生菌组小鼠肠道菌群代谢产物短链脂肪酸乙酸、丙酸、正丁酸、D-乳酸与对照组基本一致(P>0.05，表3)。

表3 四组小鼠肠道菌群代谢产物水平比较

3 讨论

肠道菌群失调指的是肠道内菌群结构发生剧烈的改变，益生菌数量急剧下降，同时伴随有害细菌的肆意滋生，使肠道代谢功能紊乱[9-11]。本研究结果显示，肝癌模型小鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和肠球菌数量较对照组均显著升高，表明肝癌的形成改变了小鼠肠道菌群的种类和数量。在干预后，GLP组和益生菌处理组小鼠肠道上述菌群数量较模型组均显著减少，且接近对照组水平，表明GLP干预可以降低肝癌小鼠体内双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和肠球菌数量，有利于维持肠道菌群的平衡。益生菌是目前临床上广泛使用的有益活性微生物，可用于改善肠道功能，帮助营养物质的消化和吸收[12-16]。DGGE分析结果显示GLP处理组和益生菌处理组小鼠肠道菌群丰富度、多样性指数和均匀度较模型组均显著升高，进一步验证了GLP参与调控肝癌小鼠肠道的微生态失衡，其作用与益生菌相当。

短链脂肪酸，诸如乙酸、丙酸和正丁酸，为机体肠道菌群独有的经典重要代谢产物，这些指标可以从侧面揭示肠道内厌氧性菌群代谢的功能状态[17]。本研究结果发现，GLP处理组和益生菌处理组肠道乙酸、丙酸、正丁酸水平较模型组均显著升高，且接近对照组小鼠水平，表明GLP干预有利于肝癌小鼠肠道菌群代谢功能的恢复，改善机体代谢紊乱状态，其机制与调节机体肠道菌群平衡密切相关[18]。D-乳酸是衡量肠道菌群增殖能力的指标，可用于指示肠道细菌增殖程度[19]。GLP处理组和益生菌处理组肠道D-乳酸较模型组均显著降低，表明GLP和益生菌处理均能够降低与D-乳酸代谢相关的有害细菌增殖，其机制可能与调控肠道内酸碱度、调控肠道粘膜免疫相关分子水平和抑制酪氨酸激酶信号转导通路有关[20]。