大豆球蛋白鼠源多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

刘德果，席 俊，王一超，付 扬

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

大豆中蛋白质含量丰富，高达40%，其组成与牛奶蛋白质相似，含有人体所有必需氨基酸，具有很高的营养价值[1]。但是大豆是公认的八大过敏原之一，过敏症状一般为皮疹、荨麻疹、呕吐、腹泻等，严重时可能出现休克甚至死亡[2]。大豆不仅以食品加工原料或制品出现在人们的餐桌上，而且作为食品添加剂具有改变食品的风味质构或者延长鲜切水果的保质期等功效[3-5]。随着大豆在食品加工中的应用更加成熟和多样，大大增加了人们对大豆及其相关制品接触的机会，导致有大豆过敏症状的人数明显升高[6]。

食物过敏原在食品中通常含量极少，且食品的成分一般比较复杂，大大增加了其检测难度[7]。大豆过敏原的检测一般有电泳法、PCR法、质谱法、色谱法、色谱-质谱法和免疫学检测法[8]。免疫学检测法具有特异性高、敏感性强和准确性高等优点[9]，且容易实现过敏原的现场快速检测。大豆蛋白根据沉降系数被分为2S、7S、11S、15S[10]，其中7S和11S含量最高[11]，且是致敏性最强的2个组分[12]，11S即是大豆球蛋白的主要组分。作者将提纯的天然大豆球蛋白免疫小鼠，制备得到鼠源多克隆抗体血清，为建立其免疫学检测技术做了铺垫。

1 材料与方法

1.1 材料

脱脂豆粉：鲲华生物技术有限公司；SDS-PAGE制备凝胶试剂盒：Biosharp公司；弗氏(不)完全佐剂：Sigma公司；羊抗鼠酶标二抗、琼脂糖凝胶CL-6B、TMB单组分显色液：北京索莱宝科技有限公司；Balb/c 雌性小鼠(6～8周龄)：河南省动物实验中心。

1.2 仪器与设备

VE180 微型垂直电泳槽：上海天能科技有限公司；Multiskan FC 酶标仪、Nanodrop2000/2000C 分光光度计：美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫原的制备

参照Deak等[13]的方法分离提纯大豆球蛋白，经过碱溶酸沉后得到大豆蛋白粗提物，然后使用琼脂糖凝胶柱CL-6B进一步分离提纯，透析除盐后测定蛋白浓度，再经SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。随后冻干，-20 ℃储存。

1.3.2 多抗血清的制备

参照Kim等[14]的方法，免疫对象为6只6～8周龄的Balb/c雌性小鼠，首次免疫将制备的大豆球蛋白与弗氏完全佐剂1∶ 1混合后均质(24 000 r/min，10 min)，随后背部皮下注射小鼠体内(50 μg/只)。3周后进行二免，二免使用弗氏不完全佐剂，其余同首免。随后每2周免疫1次。四免1周后，断尾取血并测定血清的效价及免疫学特性。

表1 免疫程序Table 1 Immunization procedure

1.3.3 多抗血清的免疫学鉴定

用CBS稀释大豆球蛋白至10 μg/mL，并加入微孔板中(100 μL/孔)，4 ℃静置10 h，加入PBST，250 μL/孔，轻微振荡4 min，倒掉并拍干，重复4次。加入5%脱脂奶粉(250 μL/孔)，封上保鲜膜，4 ℃保存。

1.3.3.1 效价测定

参考文献[15]的方法检测鼠源多抗血清的效价，吸取多抗血清至准备好的酶标板中(100 μL/孔)，并倍比稀释，稀释倍数为200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600，设置阴性与空白对照组，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1∶ 5 000倍稀释的酶标羊抗鼠抗体(100 μL/孔)，孵育1 h，洗板。加入TMB显色液(100 μL/孔)，孵育10 min。随后加入2 mol/L H2SO4(50 μL/孔)，30 s后用酶标仪测定各孔OD(450)。阳性：OD检测孔/OD阴性孔≥2.1。

1.3.3.2 敏感性测定

参照文献[16]的方法，选取效价测定中OD(450)最接近1的稀释倍数作为敏感性测定的多抗血清稀释倍数，以大豆球蛋白溶液为抑制剂。将100 μL多抗血清和100 μL大豆球蛋白溶液混合后加入备用的微孔板中，随后步骤同效价测定。计算出多抗血清对β-伴大豆球蛋白的半数抑制浓度，即IC50。

1.3.3.3 特异性测定

采用间接ELISA竞争法，以其他常见的食物过敏原为竞争物，分别测得其与多抗血清之间半数抑制率(IC50)，进一步计算得出各种物质与多抗血清的交叉反应率。选取的常见食品过敏原：β-伴大豆球蛋白、麦朊蛋白、花生蛋白、芝麻蛋白。交叉反应率(CR)=IC50(大豆球蛋白)/IC50(其他过敏原)×100%。

1.3.4 免疫印迹

将脱脂豆粉的电泳凝胶割去2个泳道，组装入模具后，转膜，随后封闭，洗涤(同ELISA)。处理后置于1∶ 5 000倍稀释的多抗血清中孵化。洗涤后置于同样倍数稀释的二抗溶液中孵化。暗室中进行ELC发光以及显影、定影。

2 结果与分析

2.1 大豆球蛋白的分离鉴定

由碱溶酸沉法得到的大豆球蛋白经过CL-6B柱层析分离，分离图谱见图1，得到2个不重叠的谱峰，1号峰较2号峰出峰时间短，且1号峰更高、峰面积更大。大豆球蛋白分子量较β-伴大豆球蛋分子量更高，且含量更高，所以1号峰为大豆球蛋白，2号峰为β-伴大豆球蛋白。SDS-PAGE电泳图见图2。由1、2泳道蛋白与5泳道蛋白比较可知，由碱溶酸沉得到的大豆球蛋白与脱脂豆粉相比，其泳道白条带清晰单一，表明蛋白质更加纯净。分析其各条带，1、2泳道中大于50 kDa的条带明显减少，这表明β-伴大豆球蛋白含量显著减少。而且大豆球蛋白的全部亚基均得到较为完整的保留，且酸性亚基含量多于碱性亚基，这与Shirotani等[17]的研究结果相似。1、2泳道和3、4泳道对比来看，3、4泳道上方的多肽链含量更少，表明经过CL-6B柱层析处理之后的大豆球蛋白的纯度进一步提高。采用BandScan软件对条带灰度值进行分析，提纯的大豆球蛋白纯度均在80%以上，符合动物免疫的要求。

图1 大豆球蛋白的CL-6B柱层析图谱Fig.1 Chromatography of soybean globulin by CL-6B column

注：M为Marker，1、2为碱溶酸沉提取的大豆球蛋白，3、4为CL-6B提取的大豆球蛋白,5为脱脂豆粉。图2 大豆球蛋白电泳图Fig.2 SDS-PAGE of glycinin

2.2 多抗血清的鉴定

2.2.1 效价鉴定

免疫小鼠个体之间生理状况、生活环境、免疫能力等差异对其产生的血清效价有比较明显的影响。采用间接ELISA分别将四免后得到的6只小鼠的血清进行效价检测。以OD检测孔/OD阴性孔≥2.1为阳性的标准，对各小鼠多抗血清效价进行鉴别，结果如表2所示。所有小鼠均对大豆球蛋白产生免疫反应，但血清的效价均有区别，其中3、5号小鼠的血清效价为1∶ 1 600左右，效价较低不符合实验要求；剩下4只小鼠的效价均已到达实验要求(高于1∶ 6 400)，其中1、2号小鼠效价最高(1∶ 12 800)，4、6号小鼠效价次之(1∶ 6 400)。

表2 小鼠四免后血清效价Table 2 Rat serum titer after four immunizations

2.2.2 敏感性鉴定

参考文献[18]的方法取效价达到要求的小鼠血清进行敏感性鉴定，结果见表3，然后将各小鼠血清的抑制率(B/B0)与lg(竞争蛋白质量浓度)进行线性拟合，随后利用拟合曲线方程计算IC50。4只小鼠血清抑制率由低到高为1、6、4、2，表明1号小鼠血清最易与大豆球蛋白发生反应，证明其血清敏感性最高。图3为各小鼠血清竞争抑制曲线，拟合曲线的线性方程为y=-0.183 1x+1.007 7，决定系数R2=0.994 2。计算得到1号小鼠半数抑制率(IC50)最低，为602 ng/mL。

表3 多抗血清敏感性鉴定Table 3 Identification for the sensitivity of polyclonal antiserum

图3 多抗血清竞争抑制曲线Fig.3 Competictive inhibition curve of polyclonal antibody

2.2.3 特异性鉴定

选取1号小鼠血清进行特异性鉴定，结果见表4。由表4可知,以麦朊蛋白、芝麻蛋白为竞争抗原与小鼠多抗血清反应，对应的IC50均大于105ng/mL，表明该多抗血清对麦朊蛋白、芝麻蛋白均不敏感。该多抗血清与β-伴大豆球蛋白有轻微的交叉反应(2.4%)，低于陈婧舒[19]制备的多抗血清交叉反应率(3.9%)，可能是由于大豆球蛋白中仍含有少量β-伴大豆球蛋白，免疫过程中引发了轻微的免疫反应。该多抗血清和花生蛋白有轻微的交叉反应(4.5%)，反映出花生蛋白有小部分结构与大豆球蛋白相似。

表4 多抗血清与其他蛋白的交叉反应率Table 4 Cross-reactivity of the polyclonal antiserum with other proteins

2.2.4 免疫印迹

使用多抗血清进行免疫印迹实验，结果如图4所示。由2、3泳道的免疫印迹图对比1泳道的脱脂豆粉电泳图可以看出，处于45 kDa以上的β-伴大豆球蛋白部分以及22 kDa附近的大豆球蛋白碱性亚基部分均没有清晰可供识别的条带，只有大豆球蛋白A2亚基附近产生了可以被清晰识别的条带，其他亚基均没有可被清晰识别的条带，表明该多抗仅与A2亚基发生强烈的抗原-抗体反应，这与该多抗与β-伴大豆球蛋白的交叉反应率低的结论相符。该现象还说明仅有A2亚基能引起小鼠较强的免疫反应，大豆球蛋白其他亚基尤其是碱性亚基并不能引起小鼠较强的免疫反应。这与郑树贵等[20]所述大豆球蛋白的酸性亚基和碱性亚基致敏性不同，酸性亚基高于碱性亚基的观点相符。但姚利利等[21]制备的兔源多抗血清与大豆球蛋白的碱性亚基和酸性亚基均有反应，与本实验获得的鼠源多抗血清有明显的区别，可能是动物种类的不同所导致。

注：M为Marker，1为脱脂豆粉，2、3均为免疫印迹。图4 多抗血清免疫印迹Fig.4 Western blot of polyclonal antiserum

3 结论

以脱脂豆粉为原料，经过碱溶酸沉和CL-6B凝胶柱层析后得到了纯度较高的大豆球蛋白，并以此为免疫原对6只小鼠进行免疫。最终有4只小鼠的多抗血清效价达到要求，其中1、2号小鼠效价最高(1∶ 12 800)；4、6号小鼠效价稍低(1∶ 6 400)。各血清IC50分别为602、3 802、1 584、630 ng/mL，1号小鼠最佳，后续测得该鼠的多抗血清特异性也较强。在免疫印迹实验中，发现该多抗仅与大豆球蛋白的酸性A2亚基反应明显,与大豆球蛋白的其他亚基均无明显反应，可能是由于A2亚基含量较高且致敏性较强，而大豆球蛋白其他亚基对小鼠的致敏性特别弱，也可能是由于动物种类差异，小鼠对大豆球蛋白碱性亚基免疫反应不强，其原因尚不明确，有待进一步研究。本研究通过免疫小鼠获得了效价较高且免疫学特性优良的鼠源大豆蛋白多抗血清，为大豆蛋白的免疫学检测提供了支持。