酵母甘露聚糖(20 kDa)的生物安全性及体内分布研究

付乾振，王佳奇，樊 坤，刘 洁，王子朝，张慧茹

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

多糖具有抗癌、抗氧化、提高免疫力[1-3]等作用，并且能辅助治疗肾脏、胃肠道、肝脏以及中枢神经系统的疾病。多糖的药理学作用研究起步较晚，主要局限于多糖的生物效应[4-5]，对其药物代谢动力学研究较少[6]。多糖是亲水性大分子，其体内分布吸收和作用机制有待完善[7]。此外，已有研究表明，分子量也是影响多糖生物活性的主要因素之一[8-9]，大多数用于抗癌药物前体的多糖分子质量为25～50 kDa，与多糖的抗癌活性和药物代谢动力学行为密切相关[10]，并且不同分子量的多糖在动物体内表现出不同的组织分布[11]。因此，以分子量为切入点，研究低分子量多糖的体内稳定性和药物吸收代谢分布，有助于了解多糖在机体内的作用机制。

酵母甘露聚糖的主链由甘露糖以α-1,6糖苷键形成的长链组成，是酵母细胞壁外层具有多种生物活性的多糖聚合物，是目前发现的免疫功能最强的细胞壁多糖，能显著增加机体免疫力、刺激肠道益生菌生长、抑制和减少病原菌等[12-13]。因此，以酵母甘露聚糖为实验材料，研究其生物安全性及在小鼠体内的吸收及分布情况，为低分子量酵母甘露聚糖在食品医疗等领域的开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

酵母甘露聚糖：西安百川生物科技有限公司；磷酸缓冲液、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、二甲基亚砜、葡萄糖：上海麦克林生化科技有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐：上海阿拉丁生化科技有限公司；抗凝剂、生理盐水：上海恒远生物科技有限公司；胰酶、乙二胺四乙酸、胎牛血清、DMEM培养基、青链霉素混合物：赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 仪器与设备

GA-3血糖仪：上海罗氏制药有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；BDF-86V158超低温冰箱：山东博科生物产业有限公司；YS-840-2超净工作台：上海箐海仪器有限公司；BCD-221EMK3A冰箱：河南新飞电器有限公司；Well scan MK Ⅱ酶标仪：美谷分子仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：常州亿通分析仪器制造有限公司；XSP-15TZ倒置显微镜：上海光学仪器厂；FA1 004 N电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 体外生物安全性检测

1.3.1.1 细胞毒性检测

参照姜宏伟[14]的方法并稍加改进。取10 mL胎牛血清、1 mLL-谷氨酰胺、1 mL非必需氨基酸、1 mL青链霉素混合液于87 mL的DMEM高糖培养基，0.22 μm滤膜过滤除菌，作为完全细胞培养液。用完全细胞培养液配制成质量浓度为10、20、40、80、160 μg/mL的酵母甘露聚糖溶液。

取对数生长期的Caco-2细胞消化离心，采用细胞计数法计数，96孔板中每孔接种8 000个Caco-2细胞，培养24 h后，弃去培养液，PBS洗两次。每孔加入不同质量浓度梯度的多糖溶液200 μL，每个梯度设5个重复，用不含多糖的细胞培养液做空白对照。于37 ℃培养箱中孵育24 h后，加MTT(5 mg/mL，pH 7.4)20 μL继续孵育4 h。小心吸取孔中所有液体后加入150 μL DMSO，振荡10 min后，检测490 nm处溶液的吸光度。

细胞增殖率=OD1/OD2×100%，

式中：OD1为实验组的吸光度；OD2为空白对照组的吸光度。

1.3.1.2 酵母甘露聚糖的溶血性检测

参照樊坤等[15]的方法并稍加改进。取小鼠血加入肝素钠抗凝管，上下轻轻混匀，加生理盐水，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液及白细胞层，再用生理盐水冲悬红细胞，重复离心3次。用生理盐水配制20%红细胞母液。精确称取1 mg酵母甘露聚糖，溶于1 mL生理盐水，得到1 mg/mL多糖母液。

在微量离心管中分别加入40、32、24、16 μL多糖母液，均与10 μL红细胞母液混合均匀，用生理盐水补足至200 μL，得到质量浓度为200、160、120、80 μg/mL的多糖、红细胞反应体系。阴性对照用生理盐水190 μL与10 μL红细胞母液混匀，阳性对照用190 μL蒸馏水与10 μL红细胞母液混匀。各组均设置5个重复。置于37 ℃培养箱孵育30 min后，离心2 min，吸取100 μL上清液于96孔酶标板中，检测540 nm处的吸光度。

溶血率=(OD1-OD3)/(OD2-OD3)×100%，

式中：OD1为实验组的吸光度；OD2为阳性对照组的吸光度；OD3为阴性对照组的吸光度。

1.3.2 多糖体内分布实验

1.3.2.1 葡萄糖的标准曲线

参照李传民[16]的葡萄糖标准曲线制作方法，配制质量浓度为100 mg/mL的葡萄糖标准溶液，将其分别稀释为0.012、0.024、0.048、0.097、0.195、0.390、0.780、1.560、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/mL的溶液,将梯度稀释的葡萄糖标准溶液用苯酚-硫酸法反应20 min后进行测定。以蒸馏水溶液为空白对照，于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，获得线性回归方程，计算肠道、内脏组织中的糖含量。

1.3.2.2 小鼠灌服及血糖含量测定

购买个体匀称、发育良好的SPF级KM小鼠(来自郑州大学动物实验中心，实验动物生产许可证编号为SCXK(豫)2017-0001)若干，在实验动物房饲养3～5 d使其适应环境。实验前一天晚上对小鼠进行断食、不断水处理。第二天称质量、分组，小鼠体重在24～26 g之间。实验组按照100 mg/kg小鼠体重的剂量灌服多糖，空白组灌服等量生理盐水。灌服后，于0、15、30、45、60、75、90、105、120 min，用GA-3血糖仪检测血糖值。

1.3.2.3 小鼠脏器糖含量的测定

分别于灌服后1、2、3 h，取空白组和实验组小鼠进行解剖，取心、肝、脾、肺、肾等脏器，称质量后，取心脏0.15 g、肝脏0.50 g、脾脏0.07 g、肺0.20 g、肾0.40 g于离心管中，与1 mL蒸馏水研磨混匀离心(12 000 r/min、10 min)之后，收集上清液。利用苯酚-硫酸法检测各脏器中糖含量。以空白小鼠的脏器糖含量做对照，计算各脏器中的糖量，分析多糖随时间在各脏器中的分布情况。

1.3.2.4 小鼠肠道糖含量的测定

灌服后，每隔30 min(即灌胃后的30、60、90 min)解剖小鼠。取含肠内容物的十二指肠、空肠、回肠于离心管中，取十二指肠0.15 g、空肠0.50 g、回肠0.30 g，与1 mL蒸馏水混匀离心(12 000 r/min、10 min)之后，收集上清液。利用苯酚-硫酸法检测各肠段中糖含量，以空白小鼠的肠道做对照组，计算残留在肠道中未吸收的糖量，分析多糖随时间在肠道中的流动和分布情况。

1.3.3 统计与分析

实验数据经Excel 2010整理后，采用SPSS软件进行ANONA显著性检验，并采用Duncan多重比较，分析各组之间的差异性。P<0.05表明差异显著，P<0.01表明差异极显著。使用Origin软件作图。

2 结果和讨论

2.1 酵母甘露聚糖对细胞的毒性

采用MTT方法检测不同质量浓度的酵母甘露聚糖对Caco-2细胞生长的影响，结果如表1所示。不同质量浓度的酵母甘露聚糖对细胞的生长没有明显影响(P>0.05)。当酵母甘露聚糖的质量浓度为10、80 μg/mL时，细胞的增殖率分别为97.17%和98.98%，其他质量浓度的酵母甘露聚糖则对细胞有轻微的促增殖作用，当质量浓度为160 μg/mL时，对细胞的增殖率促进效应最强，为115.60%，说明酵母甘露聚糖对细胞不仅无毒，还有轻微的促增殖作用。

表1 酵母甘露聚糖对细胞增殖的影响Table 1 Effect of mannan on the proliferation of Caco-2 cells

2.2 酵母甘露聚糖的溶血性检测

酵母甘露聚糖的溶血性变化如图1所示。图1表明：糖质量浓度对细胞溶血性影响较大(P<0.01)。多糖质量浓度为80、160、200 μg/mL，溶血率均为负值，略有凝血作用，多糖质量浓度为120 μg/mL时，溶血性为正值，但远远低于药典中规定的5%的溶血性，符合生物使用安全。因此，当该多糖溶液进入血液时，对机体无溶血性影响。

注：**表示差异显著(P<0.01)。图1 酵母甘露聚糖的溶血性变化Fig.1 Hemolytic change of mannan

2.3 葡萄糖质量浓度的标准曲线

葡萄糖质量浓度的标准曲线如图2所示。葡萄糖质量浓度与吸光度的线性回归方程：y=0.022 7x+0.050 7，R2=0.988 7。根据该方程计算肠道、脏器中的糖含量。

图2 葡萄糖质量浓度标准曲线Fig.2 Standard curve for glucose

2.4 酵母甘露聚糖对血糖的影响

酵母甘露聚糖对血糖的影响见图3。由图3可知，实验组和空白组的初始血糖值为3～4 mmol/L，空白组的血糖含量在前105 min时始终明显低于实验组。灌胃酵母甘露聚糖后，实验组小鼠血糖迅速上升，至45 min达到高峰，其原因可能为酵母甘露聚糖进入胃肠中后，被肠道酶分解、吸收入血，导致的血糖迅速升高，而后在胰岛素的作用下血糖逐渐降低。部分酵母甘露聚糖进入胃肠道，这与Hu等[17]研究亚洲车前草多糖的消化情况具有相似性。而Li等[18]在研究铁皮石斛多糖口服后，发现铁皮石斛多糖并不能被胃肠道消化吸收，主要调节肠道菌群。

图3 小鼠血糖变化Fig.3 Change of blood glucose in mice

2.5 酵母甘露聚糖对小鼠内脏糖含量的影响

由图4可知，血流量较大的肝脏中糖含量明显高于其他脏器。在灌胃后1 h，肝糖含量明显升高，而后逐渐下降；肺组织中糖含量也有类似的趋势；肾脏中糖含量明显高于心脏的糖含量，但肾和心脏中糖含量随时间的变化不大；脾中的糖含量随时间下降。

图4 小鼠内脏糖含量的分布变化Fig.4 Change of sugar content in mice organs

由图5可知：内脏中糖含量随时间延长而减少；灌胃后1 h，内脏糖含量提高，随后逐渐下降；肝脏中的糖含量是所有内脏中糖含量最高的，这与郑子明[19]在研究香菇多糖的药物代谢动力学时，具有相似性。多糖进入血液后，迅速集聚于肝脏，导致肝脏中糖含量较高。推测是酵母甘露聚糖形成了肝糖原储存在肝脏中，这还有待进一步实验证明。

图5 小鼠内脏糖含量变化Fig.5 Distribution of total glucose content in mice organs

2.6 酵母甘露聚糖在小鼠肠道中的流动变化

由图6可知，十二指肠中的糖含量总是低于空肠和回肠，可能是糖快速流过十二指肠，所以残存在十二指肠的糖含量较低；随着实验时间的推进，糖到达空肠，灌服30 min后空肠中糖含量较高，直至60 min左右时，酵母甘露聚糖到达回肠，造成回肠的糖含量升高。有研究报道，糖类化合物在肠道消化吸收的主要部位是空肠和回肠[20]。因此推测酵母甘露聚糖通过口服被肠道吸收后，其主要吸收场所是空肠和回肠。

图6 小鼠肠道糖含量变化Fig.6 Change of sugar content in mice intestine

由图7可知：灌胃后30 min肠道糖含量增加，60 min肠糖含量最低，90 min反而稍有升高。推测肠道糖含量的变化是几个糖去向的总和：①从肠黏膜将糖吸收入血，减少肠道中糖含量；②未吸收的糖仍能少量增加肠糖含量；③可能存在类似药物外排机制的多糖外排效应，从肠道细胞中外排多糖到肠腔中。结合血糖变化认为：酵母甘露聚糖(20 kDa)一部分可在肠道被吸收入血，分布在各脏器；另一部分随肠道流动到空肠、回肠，排到盲肠、结肠，可能参与肠道菌群益生菌群的调节[21]，这也是下一步实验的内容。

图7 小鼠肠道中糖含量变化Fig.7 Distribution of total sugar content in mice intestine

3 结论

研究结果表明：酵母甘露聚糖(20 kDa)有轻微促进细胞增殖作用；对细胞溶血率均在生物安全范围内。酵母甘露聚糖(20 kDa)具有明显的升高血糖的作用，在45 min时血糖质量浓度达到最大值，然后降低；吸收入血后分布于各个器官，肝脏的糖含量始终较高；肠道中酵母甘露聚糖随肠道流动，主要在回肠和空肠部分被吸收。研究结果有助于了解多糖在机体内的吸收分布机制，为多糖的研发提供基础数据。