限制性酶解对豆粉相关性质的影响

2019-08-22于爱华范志军郭长庆王冬梅

中国油脂 2019年6期

于爱华，范志军，陈龙，郭长庆，李波，王冬梅

(黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，黑龙江佳木斯 154007)

豆粉是大豆经过烘烤粉碎并加入一定量的添加剂制成的粉末状大豆制品[1]。豆粉不仅具有较高营养价值，而且食用方便，是目前受大众欢迎的方便速食豆制品。但是豆粉中含有致敏性的物质，限制了豆粉的发展。1995年联合国粮农组织指出90% 的食物过敏反应是因8类食物引起的，其中大豆位列第四[2]。国际免疫学会联合会过敏原命名分会官方网站上截至2012年9月24日已批准7类大豆过敏原，分别是Gly m 1(疏水蛋白)、Gly m 2(防御蛋白)、Gly m 3(细胞溶质蛋白)、Gly m 4(病程相关蛋白)、Gly m 5(7S球蛋白)、Gly m 6(11S球蛋白)、Gly m 7(种子生物素化蛋白)。其中Gly m 1和Gly m 3分别包括两个过敏原亚型；Gly m 5包括7S球蛋白α、α′、β亚基以及β亚基亚型；Gly m 6包括11S球蛋白G1、G2、G3、G4、G5亚基；Gly m 2、Gly m 4、Gly m 7尚未发现过敏原亚型。大豆过敏原相对分子质量范围为7～76.2 kD[3]。

大豆中含有多种成分的过敏原，使得大豆脱敏成为了目前研究的热点以及难点。现有的脱敏技术主要包括物理方法、化学方法和生物酶法。其中物理方法主要包括加热、辐照、高强度超声波等技术，通过改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的致敏性[4]。化学方法主要有糖基化作用和化学试剂法，通过加入糖类物质(果糖、甘露糖等)可以对大豆的一些致敏原进行掩蔽，从而降低大豆的致敏性，但化学试剂的残留会对人体产生损害[5]。生物酶法是利用酶对大豆进行酶解，使大豆中的蛋白质发生降解，产生小分子的肽类，从而起到降低大豆致敏性的作用。酶解作用不仅可以降低豆粉的致敏性，而且对豆粉的功能特性也有一定的影响，合适的酶制剂以及适度的酶解是决定豆粉口感、功能特性以及致敏性的重要因素。本文选用木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶酶解豆粉，之后通过喷雾干燥技术制备成豆粉，通过测定豆粉的致敏性、表面疏水性、乳化活性及乳化稳定性等指标，探究酶解时间以及酶制剂种类对豆粉功能特性的影响，为酶解技术应用于豆粉的生产过程提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

北大荒豆粉，北大荒绿色健康食品有限责任公司；大豆，哈尔滨九三油脂集团；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶，北京索莱宝生物科技有限公司；NaHCO3，山东皓宇新材料科技有限公司；麦芽糊精，合肥锦泰糖业有限公司；Lowry试剂盒，南京赛泓瑞生物科技有限公司；电泳试剂盒，北京索莱宝生物科技有限公司；大豆7S球蛋白ELISA试剂盒，江苏晶美生物科技有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)、5,5′ -二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、三硝基苯磺酸(TNBS)，美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

LNK-871型凯氏定氮仪；SC-3614卧式离心机；DHG-905385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱；UV-2600 紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；SDS-PAGE电泳仪；XDF-D高速分散器；DJ13B-C652SG豆浆机；PHS-3C雷磁pH计；JE502电子天平；79-1 磁力加热搅拌器；喷雾干燥机，上海比朗仪器制造有限公司；F-4500荧光分光光度计，日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 豆粉的制备

大豆在80℃下烘焙20 min，将烘焙大豆与水按1∶7的料液比磨浆，在磨浆的过程中加入适量的NaHCO3以除去豆腥味，豆浆在4 500 r/min、20℃下离心15 min，除去豆渣后，对剩余豆浆进行酶解处理(酶解用酶及相应的酶解条件见表1)，酶解后在90℃下灭酶3 min，然后与配料混合、均质，在进风温度140℃、出风温度90℃下喷雾干燥得到成品豆粉。

表1 酶解用酶及相应的酶解条件

1.2.2 豆粉水解度的测定

参照Adler-Nissen[6]的方法测定。

1.2.3 SDS-PAGE电泳分析

豆粉样品用正己烷进行脱脂处理，参照Jiang等[7]的方法进行SDS-PAGE电泳分析。配制15%和5%的分离胶和浓缩胶，12 mg/mL 的脱脂豆粉溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.4)，加入10 μL上样缓冲溶液，沸水浴90 s，用80 V的电压跑浓缩胶，120 V的电压跑分离胶，之后用考马斯亮蓝进行染色，甲醇-乙酸混合液进行脱色。在凝胶成像仪上观察凝胶样品。

1.2.4 豆粉致敏原含量测定

称取1 g豆粉样品置于离心管中，加入19 mL过敏原提取液，混合均匀，放置于摇床中，室温振荡12 h，然后于3 000×g、室温离心20 min，取上清液。将上清液过0.45 μm膜，然后用缓冲液稀释20倍作为待测样品。利用ELISA法，采用大豆7S球蛋白ELISA试剂盒对豆粉致敏原含量进行测定。

1.2.5 豆粉溶解性的测定

称取一定量的待测样品溶于去离子水中，使豆粉质量浓度为2 mg/mL，室温下搅拌30 min后，在4℃下离心30 min(12 000×g)，用Lowry法测定上清液中的蛋白质含量，根据样品中蛋白质含量和溶液中蛋白质含量计算NSI。

1.2.6 表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法[8]测定豆粉中蛋白质的表面疏水性。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液逐步稀释至豆粉质量浓度在0.04～0.2 mg/mL之间。取不同质量浓度的稀释样品2 mL，在390 nm激发波长和470 nm发射波长条件下分别测定样品的荧光强度(FI0)和样品加入10 μL ANS溶液(8 mmol/L)后的荧光强度(FI1)，FI1和FI0的差值即为FI，以蛋白质质量浓度为横坐标，FI为纵坐标作图，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质的表面疏水性指数，记为S0。

1.2.7 乳化活性和乳化稳定性的测定

豆粉样品按1∶10的料液比分散于0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀后，加入5 mL玉米油，用高速分散器在10 000 r/min下均质1 min，从测试管底部取出50 μL乳化液，用0.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液按1∶100的体积比稀释，500 nm波长处测其吸光度(A500)[9]。所有操作最少做3次平行[10]。乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)的计算公式如下。

式中：DF为稀释因子(100)；c为初始豆粉质量浓度，g/mL；Ø为光程(0.01)；θ为形成乳化液的油的体积分数(0.25)；A0和A10分别为在0 min和10 min时测得的稀释后乳化液的吸光度。

1.2.8 豆粉感官评价

10名专业的感官评价人员对在不同条件下生产的豆粉，分别从色泽、颗粒大小、味道以及溶解性方面进行感官评价。

1.2.9 数据分析

每组实验均进行3次平行实验，并将实验数据进行误差分析。用SPSS 20对数据进行分析，用Origin 8.5制图。

2 结果与讨论

2.1 豆粉水解度(见图1)

图1 不同条件下豆粉的水解度

水解度是评判豆粉酶解程度的重要指标。从图1可知，随着酶解时间的延长，豆粉的水解度明显增加(P<0.05)，这可能是由于随着酶解时间的延长，豆粉中暴露出更多的酶切位点，促进了酶解的进行，增加了豆粉的水解度。从图1也可以发现，木瓜蛋白酶的水解度明显(P<0.05)大于风味蛋白酶和碱性蛋白酶，这可能是因为木瓜蛋白酶的酶活较高[11]，因而酶解程度更大，还可能是豆粉中的蛋白质对木瓜蛋白酶的特异性结合远大于风味蛋白酶和碱性蛋白酶，因而采用木瓜蛋白酶酶解得到的豆粉的水解度更高。

2.2 豆粉中蛋白质的相对分子质量分布(见图2)

豆粉致敏性成分主要为7S、11S和疏水性蛋白等[3]，7S和11S占豆粉中蛋白质的70%，因此降低豆粉中7S和11S的含量在一定程度上能够降低豆粉的致敏性。从图2可知，利用3种蛋白酶酶解的豆粉与市售的北大荒豆粉相比，7S和11S条带变浅，说明酶解作用能够降低豆粉中7S和11S的含量，同时也产生了小分子的肽类，这可能是因为酶解作用将豆粉中的大分子蛋白质降解为小分子的肽类。随着酶解时间的延长，11S的A、B亚基含量逐渐降低，主要是因为随着酶解时间的延长，豆粉中蛋白质的酶解程度逐渐增加[12]。这一结果与Meinlschmidt等[13]研究的酶解法可以降低豆粉的致敏性结论相一致。由此可以说明酶解作用可以降低豆粉的致敏性。另外，从图2也可以看出，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶都可将大分子的蛋白质降解为小分子的蛋白质或肽类，与风味蛋白酶相比，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对豆粉的特异性较高。

注：Marker为标准蛋白；I为市售豆粉；F10、F20、F30为风味蛋白酶分别酶解10、20、30 min所得豆粉；M10、M20、M30为木瓜蛋白酶分别酶解10、20、30 min所得豆粉；J10、J20为碱性蛋白酶分别酶解10、20 min所得豆粉。

图2 不同条件下豆粉中蛋白质的相对分子质量分布

2.3 豆粉致敏原含量(见图3)

图3 不同条件下豆粉的致敏原含量

从图3可知，随着酶解时间的延长，豆粉的致敏原含量逐渐降低，利用木瓜蛋白酶酶解30 min的豆粉致敏原含量最低，为1.95%。这可能是由于酶解作用将豆粉中大分子蛋白质降解为小分子的肽类，使得豆粉中的致敏性蛋白发生降解，从而降低了豆粉中致敏原的含量。该结果与白小娟[14]的研究结论一致。在相同的酶解时间下，采用木瓜蛋白酶酶解的豆粉致敏原含量低于其他2种蛋白酶的，这可能是由于采用木瓜蛋白酶酶解豆粉的水解度较高，酶解程度大，导致致敏原的含量较低。

2.4 豆粉的溶解性(见图4)

图4 不同条件下豆粉的溶解性

由图4可知，随着酶解时间的延长，豆粉的溶解性呈现显著增加的趋势，这可能是因为随着酶解时间的延长，酶与底物接触得更充分，酶解反应更彻底，增加了豆粉的溶解性。利用木瓜蛋白酶酶解30 min的豆粉溶解性最大，NSI为88.55%。这一结果与夏明敬[15]的研究结果一致。在相同酶解时间(10～30 min)下，木瓜蛋白酶酶解得到的豆粉溶解性高于风味蛋白酶和碱性蛋白酶，这是因为蛋白质中有较多的酶切位点与木瓜蛋白酶特异性结合，使得蛋白质酶解得更充分，较大的蛋白质分子发生降解生成小分子的多肽及氨基酸等，小分子的氨基酸和多肽的溶解性更高。

2.5 豆粉中蛋白质的表面疏水性(见图5)

图5 不同条件下豆粉中蛋白质的表面疏水性

由图5可知，随着酶解时间的延长，豆粉中蛋白质的表面疏水性逐渐增加，在酶解30 min时达到最大，这可能是由于酶解作用破坏了豆粉中蛋白质间的相互作用，使得蛋白质中更多的疏水区域暴露，增加了蛋白质的表面疏水性，也可能是由于豆粉中蛋白质的结构发生了解折叠的现象，使表面疏水性增加[16]。从图5也可以看出，在相同酶解时间下蛋白酶的种类对豆粉的表面疏水性没有显著的影响。这一研究结果与刘坚[17]的研究一致。

2.6 豆粉乳化活性和乳化稳定性(见图6)

蛋白质的乳化特性可通过乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)表征[18]。由图6可知，随着酶解时间的延长，豆粉的乳化活性和乳化稳定性逐渐增加，利用木瓜蛋白酶酶解30 min得到的豆粉的乳化活性和乳化稳定性最大，分别为182.4 m2/g和120.8 min。这可能是由于延长酶解时间，促进豆粉进一步酶解，豆粉中的蛋白质结构发生改变，使更多的疏水基团暴露，从而增加豆粉的乳化活性及乳化稳定性；同时3种蛋白酶对豆粉的乳化活性及乳化稳定性也有影响，这可能是因为3种酶的作用位点不同，导致豆粉中暴露出不同的氨基酸，改变了豆粉的乳化活性和乳化稳定性。

图6 不同条件下豆粉的乳化活性及乳化稳定性

2.7 豆粉感官评价(见表2)

表2 豆粉感官评定结果

注：F10、F20、F30为风味蛋白酶分别酶解10、20、30 min所得豆粉；M10、M20、M30为木瓜蛋白酶分别酶解10、20、30 min所得豆粉；J10、J20、J30为碱性蛋白酶分别酶解10、20、30 min所得豆粉。

从表2可以看出，不同条件下制备的豆粉都呈现黄白色，采用碱性蛋白酶酶解得到的豆粉有苦味和涩味，采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解30 min得到的豆粉有微弱的苦味，在其他酶解时间下得到的豆粉有甜味而无苦味，其中木瓜蛋白酶酶解20 min得到的豆粉口感最好，与传统的豆粉口感最为相似。与传统的豆粉相比，利用酶解技术制备的豆粉呈粉末状，这可能是由于酶解作用降低了豆粉的粒径，在进行喷雾干燥后，豆粉的粒径降低，呈粉末状，与寻崇荣等[19]的研究结果相一致。酶解时间越长，豆粉越容易溶于水，这与2.4中豆粉溶解性的研究结果相一致。