大豆球蛋白提取条件优化及7S和11S 亚基的鉴定

彭 棋，阮记明，黄冬艳，王自蕊，黄柳梅，熊平文，黄建珍

(江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045)

大豆是动物重要的蛋白质资源，与谷类作物蛋白相比，大豆蛋白质具有含量高、氨基酸平衡性好，以及乳化性、吸油性等优良的理化性质而被广泛应用于食品业、医药业和动物饲料等多个领域［1-3］。而在大豆蛋白质中，大豆球蛋白占50%～90%。大豆蛋白主要由2S、7S、11S、15S 这4 种组分组成，其中7S球蛋白和11S 球蛋白是大豆蛋白的主要成分［4］。研究表明，11S 和7S 组分在理化性质、营养功能特性方面均有很大差异［5］。7S 大豆球蛋白与11S 球蛋白一样含有低量的含硫氨基酸，这相对降低了大豆贮藏蛋白的营养价值;与11S 球蛋白相比，7S 大豆球蛋白含有的巯基和二硫键较少导致其凝胶保水性和黏结性较差，而含有的赖氨酸和疏水性氨基酸较多导致其具有较强的表面活性、较好的溶解性、乳化性与稳定性。然而，11S 大豆球蛋白与7S 球蛋白在液泡型蛋白体的共同蓄积状态增加了该类蛋白的提纯难度［6］，因此对大豆球蛋白的分离提取分析对于大豆蛋白质营养品质的研究具有重要意义。

截至目前，一些学者报道了一些关于大豆球蛋白提取分离的方法［7］，如超速离心、低温沉淀、等电点沉淀、盐析、膜分离和层析分离等，但试验步骤比较繁琐，不太适合大规模生产。本研究以大豆为原材料，探讨了在不同提取液、不同pH、不同温度、不同浓度及不同料液比对大豆球蛋白提取的影响，并参考Xiao Ru［8］介绍的方法将大豆球蛋白7S 和11S 亚基进行分离提取及进一步分析。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及材料

1.1.1 试验材料与试剂 大豆由江西某饲料公司惠赠;丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、四甲基乙二胺、考马斯亮蓝G-250 均购自Amresco;低分子量标准蛋白购自中科院上海生化研究所;无水丙酮等试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器 24DN 制胶器购自北京市六一仪器厂;DYY-7C 型电泳仪购自北京市六一仪器厂;透析袋购自上海生物化学研究所;PHS-3C 型精密pH 计购自上海雷磁仪器厂;TGL-16G-A 高速冷冻离心机购自上海仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆脱脂豆粉的制备 豆粕采用PolymixA10 高速粉碎机粉碎，并过80 目筛，用丙酮脱脂3 次，抽滤，风干，即得脱脂豆粉，-20 ℃保存。

1.2.2 大豆球蛋白及2S 和11S 亚基的提取(1)不同种类提取液对大豆球蛋白提取的影响。采用pH8.5 的PBS 溶液和0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作为大豆球蛋白的提取液，料液比为1∶10提取大豆球蛋白，在55 ℃的条件下放置2 h 后，以9 000×g 离心30 min，提取上清液。

(2)不同pH 提取液对大豆球蛋白提取的影响。采用0.05mol/L 的Tris-HCl，使用pH 计，浓盐酸调节溶液pH，分别为6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 在55 ℃料液比为1∶10 的条件下放置2 h，以9 000×g 离心30 min，提取上清液。

(3)不同温度对大豆球蛋白提取的影响。采用0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作为大豆球蛋白的提取液，料液比为1∶10 提取大豆球蛋白，在25、35、45、55 ℃的条件下分别放置2 h 后，以9 000×g 离心30 min，提取上清液。

(4)不同浓度的Tris-HCl 提取液对大豆球蛋白提取的影响。采用0.01、0.03、0.05、0.10、0.20 mol/L，pH9.0 的Tris-HCl 溶液作为大豆球蛋白的提取液，料液比为1∶10，在55 ℃的保温箱内放置2 h，9 000×g 离心30 min，提取上清液。

(5)不同料液比对大豆球蛋白提取的影响。采用0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液作为大豆球蛋白的提取液，料液比为1∶10、1∶12、1∶15、1∶18、1∶20 提取大豆球蛋白，在55 ℃的保温箱中放置2 h 后，9 000×g 离心30 min，提取上清液。

(6)7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白的分离提取方法参考文献［8］。

1.2.3 大豆球蛋白的检测 采用SDS-PAGE 电泳鉴定分离大豆球蛋白。取20 μL 上清液进行上样电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶的浓度为10%。恒压电泳(浓缩胶80 V、分离胶115 V)，当溴酚蓝距胶底部5 mm 时，停止电泳。用考马斯亮蓝染色液对胶进行染色8 h，脱色2 h，直至背景无色后，用凝胶成像系统对凝胶进行扫描并分析。

2 结果与分析

2.1 不同种类提取液对大豆球蛋白提取的影响

从图1 可以看出，用这两种提取液地提取效果都比较好，pH9.0 的PBS 溶液能够更好的解离出大亚基，而pH9.0 的Tris-HCl 溶液对大、小亚基的溶解效果都比较好，所以本试验采用的是Tris-HCl 作为大豆球蛋白的提取液。

图1 不同提取液的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.1 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by different extracting solution

图2 不同PH 提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by the solution of different extracting pH

2.2 不同pH 提取液对大豆球蛋白提取的影响

从图2 可以看出，随着Tris-HCl 的pH 逐渐增大，电泳的条带越深，说明大豆球蛋白的提取程度提高了。在pH 为9.0 时，再继续提高溶液的pH，大豆球蛋白的溶解度没有增高，说明提取大豆球蛋白比较适合的pH 为9.0。

2.3 不同料液比对大豆球蛋白提取的影响

从图3 可以看出料液比为1∶18 和1∶20 基本上没有提取到多少球蛋白，料液比为1∶15、1∶12、1∶10能够提取到大部分的球蛋白，综合分析合适料液比为1∶10。

图3 不同料液比提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的电泳图谱Fig.3 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different sample-solution ratio

图4 不同浓度提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的电泳图谱Fig.4 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different solution concentration

2.4 不同浓度的Tris-HCl 提取液对大豆球蛋白提取的影响

从图4 可以看出，随着提取液浓度的升高，大豆球蛋白的溶解度也升高。在提取液为0.01 mol/L和0.03 mol/L 的情况下，基本上没有提取到大豆球蛋白，0.05 mol/L 对大豆大小亚基提取量都比较高，0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的提取液对小亚基的提取程度比较高而对大亚基的提取量比较低。综合分析提取大豆球蛋白的Tris-HCl 合适体积分数为0.05 mol/L。

2.5 不同温度对大豆球蛋白提取的影响

从图5 可以看出，25 ℃～55 ℃温度段，随着温度的提高大豆球蛋白的溶解度逐渐增大，所以综合各因素考虑可得在55 ℃时提取率比较高。

图5 不同温度提取液提取大豆球蛋白的SDS-PAGE 的电泳图谱Fig.5 SDS-PAGE pattern of soybean GLObulin extracted by solution of different temperature

图6 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白粗提物的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.6 SDS-PAGE pattern of extraction of 7-conglycinin GLObulin and 11S GLObulin

2.6 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白粗提物的SDS-PAGE

将伴大豆球蛋白和11S 球蛋白回收液与样品缓冲液1∶1 混合，上样电泳(电泳条件如1.2.3)，电泳结果见图6。从图6 可以看出，7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白得到了较好的分离。

2.7 7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白分子量的确定

根据(图6)标准蛋白的相对分子质量与迁移率呈线性关系，我们通过Excel2003 软件做了以下曲线(图7):

图7 标准蛋白质的分子量(Mr)与相对迁移率(Rf)的关系曲线Fig.7 Relationship between Rf and lgMr of stander protein

根据标准蛋白的相对分子质量与迁移率的线性关系曲线得到:y=-0.909 3x+5.054 3(R2=0.99)。根据相对迁移率计算后得出7S 伴大豆球蛋白的三个亚基α’、α、β 的分子量分别是60 466 Da、55 029 Da、49 043 Da;11S 球蛋白的3 个亚基A3、A、B 的分子量分别为44 634 Da、39 779 Da 和17 952 Da。

3 结论与讨论

综合大豆球蛋白得率、蛋白含量、纯度和亚基含量以及相互作用等分析结果，大豆球蛋白在55 ℃、0.05 mol/L、pH9.0 的Tris-HCl 溶液且料液比为1∶10 浸提2 h 能够提取较多的球蛋白，并且7S 伴大豆球蛋白由3 个亚基组成，其分子量分别为60 466 Da，55 029 Da 和49 043 Da，11S 球蛋白也由3 个亚基组成，其分子量分别44 634 Da，39 779 Da 和17 952 Da。这与之前学者所得到的结果略有出入［9］，由于对7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白的分离、提纯是相对的，再加上测定方法和测试材料的差异性，使得7S 伴大豆球蛋白和11S 球蛋白组分各个亚基的相对分子质量尚缺乏统一的结论，但仍然可以作为后续研究作参考。许多试验研究发现大豆球蛋白溶解性的影响因素是大豆球蛋白与蛋白质及蛋白质与水之间的相互作用的平衡［8］。其中内在因素包括疏水作用力［10］，氢键作用等［11］;外在因素包括pH［12］、盐的种类［12］和离子强度［13］等。本试验也发现，虽然本试验采用pH 都为9.0 的PBS 溶液和Tris-HCl 溶液作为大豆球蛋白的提取液，虽然PBS 溶液对球蛋白大亚基的提取程度稍微高一点，这可能是PBS 溶液当中一定浓度离子增加了亚基的溶解度的原因，但是Tris-HCl 对大豆球蛋白的大小亚基的提取程度都比较高。

影响球蛋白溶解的一个重要的原因包括溶液的pH，本实验观察到pH 从7.0 升高到9.0 时，大豆球蛋白的溶解度不断增加，当增加到9.0 时，溶解度不再增加，所以本实验认为大豆球蛋白浸提液pH 为9.0的提取效果比较好。一些研究表明，大豆球蛋白浸提液Tris-HCl 的合适pH 为8.5［6］，原因可能是不同地区的大豆本身有一定的差别，但本实验与其他的实验结果相差不是很大，仍可以为今后的研究提供重要的参考依据。

本实验按照3.1 及3.2 得到的实验结果确定提取液为pH9.0 的Tris-HCl，再改变提取液的料液比。从图3 可以看出，料液比为1∶18 和1∶20 提取率低，而料液比为1∶15、1∶12、1∶10 提取率高，并且1∶10的料液比大豆球蛋白的提取率最高。而且过高的料液比在实际生产和实验室操作中会降低处理能力，综上本试验认为料液比为1∶10 提取效果最佳。

一些研究表明0.03～0.06 mol/L 的Tris-HCl 缓冲系统能够提取到大量的球蛋白［6］，因为大豆球蛋白会因溶液的离子强度变化发生分子聚合解离作用，即大豆球蛋白具有缔合—解离反应。在0.1 mol/L 离子强度和中性pH 值下，大豆球蛋白会聚合成其他蛋白;而在低离子浓度和弱碱性条件下，能解离成其他组分，即增加了溶解度［5-6］。本实验结果也表明在Tris-HCl 的浓度为0.05 mol/L 时球蛋白大小亚基的提取率最高。当提取液体积分数继续增加到0.1 mol/L 时，虽然球蛋白的小亚基提取率增加，但对球蛋白大亚基的溶解有一定的抑制作用，同时还增加了浸提液的成本。

研究表明，在大豆球蛋白的分离过程中，在温度为80 ℃以下，得率会随温度上升皆呈上升趋势［14］。但是，本试验所得的结果是在25 ℃～55 ℃时，随着温度的升高，大豆球蛋白的得率也会不断增加，在55 ℃时最高，所以认为在55 ℃时提取效果比较好。本试验认为虽然随着温度的升高，大豆蛋白的溶解度会适当增加，但是温度太高的话，会使得蛋白质发生变性，这样大豆蛋白的得率会降低。

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