人结直肠癌裸鼠皮下瘤模型的3.0 T MRI参数优化及功能成像评估

贾好东 方昕 张中原 韦巍 赵娜 董江宁

结直肠癌在恶性肿瘤中的发病率居第三位［1］。建立适当的人结直肠癌动物模型对结直肠癌的发生机制研究及抗肿瘤研究起到至关重要的作用［2］。裸鼠因其缺乏T 淋巴细胞功能，且裸鼠皮下移植瘤模型易于建立和观察，成瘤率高，是最为常用的肿瘤移植模型材料［3］。MRI 可动态观察和反映裸鼠的病理学变化，越来越多的应用于动物肿瘤模型的研究［4,5］。裸鼠体积小，采用临床型磁共振所获得的驰豫信号弱，图像质量常常不能满足对裸鼠模型做深入研究的要求［6］。目前，4.0 T 以上等超高场小孔径专用磁共振设备因其价格昂贵，很难在国内多数科研机构及医院得到普及。研究表明，临床上应用的磁共振仪通过选择合适的成像线圈、优化磁共振扫描序列及扫描参数，可以提高裸鼠成像质量［7］。本研究在前人临床型磁共振扫描小鼠的基础上进行参数优化，并采用体素内不相干扩散加权成像（intravoxel incoherent motion diffusion weighted imaging，IVIM-DWI）结合三维动脉自旋标记成像（three-dimensional arterial spin labeling，3D-ASL）评估裸鼠皮下瘤模型的微观病理生理学变化，为实验性的肿瘤分子影像学研究提供可行的实验操作方法、技术和参数。

资料与方法

1.实验动物与细胞

本研究经安徽省肿瘤医院（中国科学技术大学附属第一医院西区）医学伦理委员会批准（2020-YXK-03）。实验动物：严格遵照《关于善待实验动物的指导性意见》妥善处理实验动物。Balb/c雄性裸鼠20 只（购自合肥市庐阳区义东生物用品经营部），5 周龄，体重（21±3.0）g，由中国科学技术大学附属第一医院动物中心饲养。饲养条件：恒温22 ℃，相对湿度50%，供应无特定病原（specific pathogen free，SPF）级饲料、饮水。SW480 人结直肠癌细胞株（购自ATCC）。细胞株采用含有10%胎牛血清和双抗（100 U/ml 青霉素+SW480 人结直肠癌细胞株，100 ug/ml 链霉素）的DMEM 培养基，在恒温37 ℃、饱和湿度、5%CO2的条件下培养，使细胞贴壁生长。采用胰酶消化法进行传代，每3～4 d 传代一次。

2.人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

取对数生长期SW480 人结直肠癌细胞，用0.25%胰酶制成单细胞悬液。饲养裸鼠约7 d，待其适应饲养环境后接种细胞，按2～4×106/只接种于裸鼠右肩胛骨区皮下。每天由饲养员观察裸鼠皮下瘤生长情况，6 周左右，皮下瘤长径生长至1～1.5 cm 时行MRI 扫描。

3.两组3.0 T MRI 的扫描序列与参数

所有裸鼠扫描前均进行精确称重，腹腔注射戊巴比妥钠（3%，40 mg/kg），待裸鼠被深度麻醉后将裸鼠俯卧位固定于自制固定物上。将固定好的裸鼠头先进俯卧位放入4 通道相控阵MRI 老鼠实验线圈（上海辰光医疗科技有限公司，CGMUC22-H300-AG）。在裸鼠表面盖上棉絮以保暖。定位成功后进床至GE Signa HDxt 3.0 T 磁共振仪的扫描位开始扫描。前后两批裸鼠随机分组，分为A、B 两组，常规序列参数见表1。A、B 组的IVIMDWI 扫描序列参数相同，具体参数如下：TR 4000 ms，TE 102 ms，视野8 cm×8 cm，层厚2.5 mm，层间距0.5 mm，体素1.5 mm×1.5 mm×2.0 mm。采用9 个b值，分别为0、20、50、100、150、200、300、500、1000和2000 s/mm2。A、B 组的3D-ASL 扫描序列参数相同，具体参数如下：TR 4771.0 ms，TE 14.2 ms，层厚4.0 mm，重复次数（NEX）3.0；层数11，层间距0.5 mm，视野8.0 cm×8.0 cm，矩阵256×224。经尾静脉注射钆喷酸葡胺（Gd-DTPA，北陆药业），注射量为0.1 ml/只，之后行增强扫描，扫描参数同横断位T1WI 序列。

表1 A、B 两组裸鼠3.0 T MRI 常规扫描参数

4.图像质量主观评价

由2 名具有实践经验的主管技师和主治医师各自独立对裸鼠横断位T1WI、横断位T2WI、增强、IVIM-DWI 及3D-ASL 序列进行图像质量评估，均在不知情前提下，主观评估裸鼠图像质量。

5.图像质量客观评价

由两名经验丰富的副主任医师分别在裸鼠皮下瘤MRI 平扫与增强图像上各自选取肿瘤、同层面肌肉组织及背景区取三个兴趣区（region of interest，ROI）进行信号测量，ROI 大小约6 mm2，计算信噪比（signial to noise ratio，SNR）及对比噪声比（contrast-noise ratio，CNR），取平均值。通过计算组内相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC），评价两位副主任医师得到SNR 及CNR 数据时的一致性。公式如下：

注：S瘤为肿瘤组织信号强度，S背为背景区域信号强度，S肌为正常肌肉组织信号强度，Sd为背景噪声的标准差。

6.IVIM-DWI 及3D-ASL 数据测量

由两名副主任医师各自在ADW 4.5 工作站上打开Functool 软件，依次打开要处理的IVIM-DWI及3D-ASL序列，并得到ADC、D、D*、f 及BF（blood flow）值伪彩图；分别在IVIM-DWI 及3DASL 图上选取信号最高处为ROI，并对每例裸鼠的各伪彩图测量三次并取平均值。通过计算ICC评价两位副主任医师在测量IVIM-DWI 及3DASL 参数的数据时的一致性。

7.肿瘤组织的病理学观察

裸鼠磁共振扫描结束后，立即处死，剥离皮下瘤，称取移植瘤重量。将肿瘤组织用4%多聚甲醛固定，制成石蜡切片，组织切片HE 染色观察结直肠癌细胞密度，免疫组化Ki-67 染色观察结直肠癌细胞增殖情况，免疫组化血管染色观察皮下瘤微血管生成情况。

8.统计学方法

采用SPSS 16.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2组间比较采用独立样本t 检验。非正态分布的计量资料以中位数M（四分位间距P25，P75）表示，2组间比较采用Mann-Whitney U 检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.裸鼠移植瘤成功率

SW480 细胞接种后约10 d，裸鼠右肩胛骨区形成肉眼可见的小结节，触之质地较硬。6 周左右，皮下瘤长径生长至1～1.5 cm。本组实验裸鼠皮下瘤裸鼠成瘤率100%。

2.图像主观评价

主观评估裸鼠图像质量剔除研究标准为：（1）边界不可辨别或大部分边界不清；（2）有明显伪影，图像显示信号不均匀，无法完成参数值测量；（3）解剖结构显示模糊，DWI 图变形严重。B 组1 只裸鼠有严重运动伪影被剔除。

3.图像客观质量

15 只（100%）裸鼠在MRI 上均显示成瘤，肿瘤信号与邻近组织相比，病灶T1WI 上呈均匀等或稍高信号；在T2WI 上呈较均匀稍高信号。2 只裸鼠肿瘤中央出现无强化低信号坏死区。所有图像均测量了要求部位的信号强度及背景噪声值。两位副主任医师单独描绘的ROI 所得SNR 及CNR 数值的一致性均达到良好以上（ICC：0.835～0.945）。将第一位副主任医师的数据用于随后的分析，A、B 两组裸鼠不同序列SNR 与CNR 见表2。A 组横断位T1WI 及增强序列SNR 均大于B组，差异均具有统计学意义（t=2.836，P=0.014；t=4.339，P<0.01）。A 组增强序列CNR 大于B 组，差异有统计学意义（t=6.913，P<0.01）。分析结果显示A、B 组图像均可满足临床与科研要求，A 组图像质量整体优于B 组（图1、2）。

图1 A 组4 号裸鼠，雄性，11 周，体重21.3 g。a)T1WI 横断位俯卧位示皮下瘤位于右侧肩胛骨区，边界清楚，呈等信号，皮下瘤组织SNR=58.32，CNR=16.68；b)T2WI 横断位；c)T1WI 增强，皮下瘤呈明显强化，皮下瘤组织SNR=104.83，CNR=58.33 图2 B组5 号裸鼠，雄性，11 周，体重18.5 g。a)T1W 横断位俯卧位示皮下瘤位于右侧肩胛骨区，边界清楚，呈等信号，皮下瘤组织SNR 为35.29，CNR 为5.62；b)T2WI 横断位；c)T1WI 增强，皮下瘤呈轻中度强化，皮下瘤组织SNR 为68.92，CNR 为27.81

表2 A、B 两组裸鼠不同序列SNR 与CNR

4.IVIM-DWI 及3D-ASL 相关参数结果（图3、4）

图3 A组4 号裸鼠，雄性，11 周，体重21.3 g。a)ADC 伪彩图，肿瘤组织平均ADC 值0.531×10-3 mm2/s；b)慢速表观扩散系数D 值的伪彩图，肿瘤组织平均D 值0.412×10-3 mm2/s；c)快速表观扩散系数D* 值的伪彩图，肿瘤组织平均D* 值12.31×10-3 mm2/s；d)灌注分数f 值的伪彩图，肿瘤组织平均f 值0.15；e)3D-ASL 血流量BF 值的伪彩图，肿瘤组织平均BF 值15.94 ml·min-1·100 g-1 图4 B组5 号裸鼠，雄性，11 周，体重18.5 g。a)ADC 伪彩图，肿瘤组织平均ADC 值0.482×10-3 mm2/s；b)慢速表观扩散系数D 值的伪彩图，肿瘤组织平均D 值0.173×10-3 mm2/s；c)快速表观扩散系数D* 值的伪彩图，肿瘤组织平均D* 值1.25×10-3 mm2/s；d)灌注分数f 值的伪彩图，肿瘤组织平均f值0.473；e)3D-ASL 血流量BF 值的伪彩图，肿瘤组织平均BF 值16.93 ml·min-1·100 g-1 图5 a)裸鼠皮下瘤病理学HE 染色图（×200），肿瘤细胞密度高，多呈类圆形，胞浆淡染，细胞核大小、形态、染色不一，部分区域可见双核；b)裸鼠皮下瘤病理免疫组化染色图，Ki-67 增殖指数80%（×200）；c)裸鼠皮下瘤病理血管染色图（×400），肿瘤内部被染成棕黄色的为血管内皮或内皮细胞束（+++）

两位副主任医师单独描绘的兴趣区所测得的IVIM-DWI 及3D-ASL 参数值的一致性均达到良好以上（ICC：0.767～0.943）。将第一位副主任医师的数据用于随后的分析。肿瘤组织ADC、D 及D*值均小于同层面正常肌肉组织，差异均具有统计学意义（P<0.05），肿瘤组织BF 值大于同层面正常肌肉组织，差异有统计学意义（P<0.05），肿瘤组织f 值大于同层面正常肌肉组织，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

表3 裸鼠皮下瘤与同层面肌肉的IVIM-DWI 及3D-ASL相关参数指标比较

5.病理结果

皮下瘤病理均诊断结直肠腺癌；瘤体表面血供较丰富，包膜完整，与邻近正常肌组织分界较清。镜下观察肿瘤细胞密度高（图5a），Ki-67 增殖指数（proliferation index，PI）高（图5b），免疫组化血管染色（+++）（图5c）。

讨 论

1.裸鼠皮下瘤模型在临床型MRI 研究中的问题

MRI 具有较好的软组织分辨率以及较高的时间、空间分辨力，因此在裸鼠实验研究中应用越来越多。但由于裸鼠体积小、体重轻，与动物线圈之间常存在较大缝隙，另外因为裸鼠的呼吸和不自主运动等因素的负面影响，在临床型3.0 T MRI 中所做的裸鼠研究图像质量往往不佳［6,7］。针对这一问题，本研究尝试对临床型3.0 T MRI 扫描进行参数优化，以获得优质的裸鼠MRI 解剖图像。目前，裸鼠皮下瘤实验主要通过病理学和免疫组织化学（immunohistochemical，IHC）来验证其内部微观结构变化，但此方法不仅有创且花费时间较长［8］。因此本研究尝试采用IVIM-DWI 及3D-ASL 技术来反映皮下瘤内的微血管生成和细胞密集度的状况。

2.裸鼠皮下瘤3.0 T MRI 参数优化

要想用临床型3.0 T MRI 评估裸鼠皮下瘤模型，不仅需要规范的检查技术，还需通过参数的优化得到高的SNR 及CNR。SNR 越高、正常组织信号成分占比越多、图像越清晰。影响SNR 的因素中最常见的是成像参数的设置，但高SNR 图像并不一定具有优质的图像对比度，如果组织对比度不高，SNR 再高也无法满足临床科研要求［9］。本研究在参考孙佳等［10］扫描序列参数基础上，根据小鼠扫描经验对扫描参数进行优化，适当延长了T1WI 的TR 值，因为适当提高TR 值可使质子纵向磁化矢量相对恢复较充分从而提高组织的信号值，同时还间接提高组织间纵向弛豫的差值从而提高组织的对比度。本研究A 组裸鼠平扫横断位T1WI 序列的SNR 大于B 组，差异有统计学意义。分析原因如下：本研究保持视野不变，A 组裸鼠T1WI 序列矩阵为256×224，小于B 组矩阵256×256，此时，扫描矩阵与SNR 的关系是SNR 与相位编码平方根成反比［11］，所以A 组SNR 较高。虽然A 组矩阵小，空间分辨力略低，但这不仅没有影响图像质量反而还缩短了扫描时间。本研究中A 组T1WI 增强序列的SNR 及CNR 均大于B 组，差异均有统计学意义，主要因为平扫时A 组的SNR 大于B 组，所以在相同的增强条件及病灶同等强化程度下A 组仍具有较高的SNR。A 组增强序列的CNR 高于B 组，可能由于A 组空间分辨率较小，相应获得噪声信号也较少。此外MRI 平扫时A 组皮下种植瘤灶虽然较B 组具有高的SNR，但其与皮下肌肉均为低信号，固有差别较小，对比并不显著。但增强后皮下瘤明显强化，皮下肌肉不强化，这导致A 组原本高SNR 的皮下瘤与皮下肌肉固有差别明显增大，使A 组增强后CNR 值增高。

3.功能成像对裸鼠皮下瘤评估的价值

与冯仕庭等［12］等研究相比，本研究在对裸鼠常规平扫和增强的基础上，增加IVIM-DWI 及3D-ASL 扫描，对裸鼠皮下瘤模型的病理生理学变化评价更加全面。基于双指数模型的IVIM-DWI序列利用多个b 值采集DWI 序列图像，可有效分离水分子的扩散信息和血流微循环灌注信息。且通过量化指标，能更准确地反映水分子扩散程度［13,14］。单指数模型的DWI 技术所获得的ADC 值并不是裸鼠皮下瘤组织水分子的真实扩散情况，因其还受到微循环灌注的影响。而双指数模型的IVIM-DWI 获得的D 值代表真正的水分子表观扩散值，剔除了血流灌注的影响，直接反映皮下瘤癌细胞密集度，从而间接提示结直肠癌的分化程度［15,16］。本研究肿瘤组织的D 值及ADC 值均明显低于同层面肌肉组织，笔者认为这是因为本研究皮下瘤结直肠癌细胞密度大、排列紧密、细胞间隙小，致使细胞外间隙内水分子扩散受到限制，导致ADC 值和D 值的降低。D* 值代表体素内微循环灌注的扩散效应，反映了毛细血管的平均血流速度。本研究发现结直肠癌皮下瘤D* 值小于同层面肌肉组织，可能因为种植瘤内虽然出现大量新生毛细血管网，但是这些血管网生成方式紊乱，血管不成熟，血管内易产生脉管癌栓，使瘤体内毛细血管平均血流速度降低［17,18］。f 值代表体素内毛细血管容积占整个组织容积的比值，反映的是新生的毛细血管总量。本研究瘤体组织的f 值明显大于同层正常肌肉组织，表明瘤体组织新生血管较多，血供丰富，本研究皮下瘤细胞Ki-67 增殖指数高，表明细胞增殖能力强，血管染色结果表明微血管生成丰富，均支持上述结论。

3D-ASL 作为一种容积灌注成像技术，突破了信噪比等因素的制约，对发现组织血流灌注异常的敏感性更高［19］。本研究还对裸鼠结直肠癌皮下种植瘤进行了3D-ASL 序列扫描，尝试在不打对比剂状况下观察瘤内血流量值的可行性。此次试验采用脉冲式动脉自旋标记技术，自心脏上缘向下采集，主要考虑裸鼠较小无需大范围的扫描覆盖并降低射频能量，减少因长时间扫描引起死亡的可能性，其次还可以减小磁化转移效应并相对提高SNR。本研究肿瘤组织的BF 值明显大于同层面肌肉组织，说明皮下瘤组织有较高的血流灌注，反映出本研究裸鼠皮下瘤新生血管较多，肿瘤血供较为丰富，皮下瘤病理学免疫组化血管染色的结果也证实了这点。

研究的不足之处：（1）由于实验的动物模型数量有限，测量的数据难免存在偏倚；（2）裸鼠结直肠癌皮下瘤试验后的病理切片与MRI 扫描层面的匹配存在一定误差。