脑白质疏松症患者Claudin基因的多态性调查与认知功能的关系

陈艳 马飞凤 何莹超，3 刘德山，3 郑峥，3*

脑白质疏松症（1eukoaraiosis，LA）又被称之为脑白质损害或者是脑白质高信号，为目前已知的脑小血管病的常见类型［1］。该病症发病率与年龄的增长呈正相关性，绝大多数患者起病早期无任何症状表现，随着病程时间的延长将会导致脑功能损伤，增加认知与精神障碍、脑血管疾病、帕金森病等多种神经系统疾病发生风险［2］。随着人口老龄化问题的日趋显著，LA 成为全球医学界面临的一个公共卫生问题，故探讨其发病机制并寻求行之有效的防控对策迫在眉睫［3］。血脑屏障破坏被认为是LA 发生的早期环节，而Claudin基因在维持脑微血管内皮细胞功能及其间的紧密连接结构中扮演着重要的角色［4］。国外研究表明，Claudin⁃1基因的rs9290927基因型与韩国人群脑白质疏松症有关［5］。然而，中国LA患者Claudin基因多态性以及与认知功能的关系尚未有研究涉及，故本研究以此为目的展开分析。

1 临床资料

1.1 一般资料选取我院2019 年1 月-2020 年1 月收治的100例LA患者为LA组，50名健康体检者为对照组。LA组中男58 例、女42 例；年龄：62 岁-78 岁，平均年龄（66.89±1.41）岁；病程时间：6个月-2.5年，平均病程时间（1.35±0.20）年；改良Fazekas分级：2级35例、3级50例、4级15例；基础疾病：高血压35例、糖尿病28例、高脂血症25例、高同型半胱氨酸血症12 例；吸烟史：有吸烟史63例、无吸烟史37例；饮酒史：有饮酒史55例、无饮酒史45例。对照组中男30名、女20名；年龄：60岁-76岁，平均年龄（66.82±1.53）岁；吸烟史：有吸烟史32 例、无吸烟史18 例；饮酒史：有饮酒史30 例、无饮酒史20例。纳入标准：（1）年龄≥60 岁；（2）神经系统检查无明确神经系统阳性体征；（3）受试者如实知晓本研究方案内容并自愿参与。排除标准：（1）合并心脑血管疾病或者是心力衰竭/呼吸衰竭；（2）既往有神经系统器质性疾病病史；（3）其他疾病所致的脑部脱髓鞘改变；（4）研究开始前6 个月服用过影响认知功能的药物；（5）磁共振检查提示皮质萎缩。两组受试者性别、年龄、吸烟史、饮酒史间差异无统计学意义（P>0.05），有可比性。本研究已经通过医学伦理委员会审核。

1.2 方法采集所有受试者空腹静脉血3 ml，以2500 转/min 离心15min 后分离血浆。利用低渗法分离血浆中的白细胞，采用饱和酚⁃氯仿提取DNA。将提取的DNA 置于1.5 ml 的Eppendoff 管中并利用TE 溶液溶解，70%乙醇反复漂洗2 次后置于4℃冰箱中保存。利用DNAstart 软件设计目标基因CLDN 的SNP（CLDN1 的rs17501010、rs893051 和rs9290927）多态位点附近的DNA 片段扩增引物，寻找合适的限制性内切酶并利用聚合酶链反应扩增目的DNA，具体如下：采用生工生物工程（上海）股份有限公司制备的Taq⁃man 探针对目标基因进行分型，将探针分别于3'，5'端标记荧光基团及淬灭荧光基团，扩增时探针退火并对探针上的荧光分子进行切割，经酶切后跑琼脂糖凝胶电泳检测限制性片段长度多态性以确定单体基因型，如个别基因多态位点无法寻找到合适的限制性内切酶，则将PCR 产物纯化直接进行基因测序分析（由上海生工完成），应用Chromas 软件读取基因测序图谱以确定基因型。

1.3 观察指标选取认知功能评分、Claudin⁃1 SNP 位点rs17501010、rs893051、rs9290927 基因型及等位基因频率为观察指标。认知功能评分包括MMSE 评分、MoCA 评分，其中MMSE 评分利用简易精神状态量表（mini⁃mental state ex⁃amination，MMSE）［6］评定，总分30 分，≥27 分为正常，MoCA评分利用蒙特利尔认知评估量表（montreal cognitive assess⁃ment，MoCA）［7］评定，总分30 分，≥26 分为正常。

1.4 统计学处理采用SPSS 25.0 统计软件对数据进行处理，计量资料采用（）表示，计数资料采用率（%）表示，比较以χ2检验。采用多元非条件Logistic 回归分析模型检验Claudin 基因多态性与认知功能的关系，以OR 及其95%CI 表示，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组认知功能评分比较见表1。

表1 两组认知功能评分比较（±s，分）

表1 两组认知功能评分比较（±s，分）

注：与对照组相比较，*P<0.05。

组别对照组LA 组n 50 100 MMSE 评分28.25±1.05 25.55±1.35*MoCA 评分27.33±1.01 25.10±1.35*

2.2 Claudin 基因多态性与LA 患者认知功能障碍的相关性见表2。

表2 Claudin 基因多态性与LA 患者认知功能障碍的相关性

3 讨 论

LA 为神经传导纤维诱导的弥漫性脑缺血，X 线计算机断层摄影表现为脑室周围低密度影，磁共振成像则表现为T2 加权像高信号影［8］。研究表明，LA 会导致患者出现认知功能减退，故被认为是脑认知功能损害的早期标志之一［9］。随着临床研究的不断深入，相当数量的LA 患者存在认知与行为障碍，如表情淡漠，记忆力、判断力和反应能力下降，语言功能障碍、视觉功能障碍等［10］。诱发LA 的机制多样，包括慢性缺血/低灌注学说、血脑屏障破坏学说、内皮功能障碍学说、炎症反应学说、遗传学说、静脉异常学说等［11］。基因遗传学研究为国内外研究领域的热点，特别是LA 具有高度可遗传性，发生几率高达55%-80%，其遗传机制可能与染色体基因组遗传变异有关，包括单核苷酸多态性、拷贝数变异，非正常的基因表达等。Claudin 基因为构成脑微血管内皮细胞间紧密连接的重要蛋白家族，在维持其结构完整性及功能方面发挥了重要的作用［12］。有研究已经发现Claudin⁃1缺失与脑卒中的发生密切相关［13］。由此使得Claudin基因成为LA基因遗传学研究的候选基因之一。

本研究发现LA 组认知功能评分（MMSE 评分、MoCA评分）均小于对照组，表明LA 患者普遍存在着认知功能减退，此点与已有研究结论相吻合。进一步研究发现，Clau⁃din⁃1 SNP 位点rs17501010、rs893051、rs9290927 与LA 认知功能障碍在加性模型、显性模型、隐性模型中均存在关联性，提示LA 患者Claudin 具有基因多态性特点，但不同基因型发挥的作用不尽相同，其中各个位点的GG基因型容易发生认知功能障碍，而GC、CC 基因型却并不会对认知功能造成影响。出现此种差异的原因可能与不同基因型所具有的“催化”或“唤醒”功能差异有关，GG 基因具有催化限制性内切酶的作用，由此使得DNA 的复制容易突破个体的控制而出现异常表达，而GC、CC 或许扮演的角色与GG 基因相反，即抑制限制性内切酶活性，维持特定基因的正常表达。但是，需要指出的是，本研究中LA 患者均存在基础疾病，提示Claudin 基因可能只有在特定的环境中才会发挥出相应的作用，如合并基础性疾病、受到外界刺激等。因此，关于Claudin 基因多态性及与LA 的关系尚有待于今后更为深入的研究。综上所述，LA患者Claudin基因具有基因多态性特点且参与到了认知功能障碍的发生进程之中。