柚子皮挥发油减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用

田鑫悦 谢露 王文艳 邹鑫森 赵高阳 袁张莉 莫燕资 张波 陈蒙华*

缺血性脑卒中是由于脑血管堵塞导致脑组织血流供应中断，使该血管所供应的脑组织出现缺血、缺氧和能量衰竭而导致脑细胞死亡的脑部疾病。目前机械取栓及溶栓等治疗均可恢复缺血组织血液供应，但随之会导致脑梗死面积进一步扩大，损伤加重，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。CIRI 会引起免疫系统激活，诱发炎症级联反应加重损伤。小胶质细胞和星形胶质细胞作为抵抗脑缺血损伤的第一道防线，与CIRI 密切相关。柚子皮挥发油（pom⁃elo peel volatile oil，PPVO）是将柚子皮以蒸馏形式获得的提取物，柚子皮提取物具有抗氧化，抗炎抑菌，抗病毒和抗黑色素生成多种生物活性，且已被证实可在短暂性全脑缺血模型中预防缺血性脑损伤［1，2］。本研究拟通过大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的病理表现以及脑常驻胶质细胞的表达，进一步探索PPVO 的神经保护作用。

1 材料和方法

1.1 柚子皮挥发油的制备PPVO 取材自2019年9 月从广西壮族自治区容县沙田村采集的成熟柚子新鲜果皮（Cirtrus grandis（L.）Osbeck var.shatinyu Hort）。柚皮经纯水洗涤后，除去果肉和白色果皮，得到最外层富含油胞的黄色柚皮，并切成1.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 的小块放在入无菌容器中，并使用蒸馏器通过冷却系统蒸馏，2 h 后将水和PPVO 分离，300 μL 柚子皮挥发油是由150 g 柚子皮经3 次蒸馏富集所得，所得PPVO 置于4℃环境保存。

1.2 仪器与试剂TTC 购于美国Sigma 公司。线栓购于中国广州佳灵生物技术有限公司。甲苯胺蓝溶液、苏木精溶液、伊红溶液均购于中国Solarbio公司。光学显微镜、荧光显微镜购于日本Olympus公司。兔多克隆抗GFAP 抗体（1∶50，万类生物，中国，#wl0836），兔单克隆抗Iba 1 抗体（1∶50，CST，美国，#17198）。二抗（1∶500，GB23301）、BSA 均购于中国Servicebio公司。

1.3 动物模型制备（1）实验动物本实验选取健康成年Sprague⁃Dawley（SD）大鼠40 只，6-8 周龄，220-250 g，购于广西医科大学实验动物中心。包括动物在内的所有程序均已得到动物保护委员会和广西医科大学伦理委员会的批准。（2）实验动物分组及局灶性脑缺血再灌注损伤模型建立大鼠按随机数字表法分为5 组（n=8/组），分别为：假手术（SH）组，模型（NS）组（2 mL/kg），甘油溶剂组（GL）组（10%甘油，2 mL/kg），低剂量（LP）组（10 mg/kg）和高剂量（HP）组（30 mg/kg）。PPVO 溶解在10%甘油中使用，所有药物均经腹腔注射给药。SH 组大鼠给予分离颈总及颈内、外动脉，但不阻塞大脑中动脉。所有大鼠术前12 h 禁食，可自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mg/kg）将大鼠麻醉后，仰卧位固定于手术板上。短暂性大脑中动脉堵塞/再灌注（transient middle cerebral artery occlu⁃sion/reperfusion，tMCAO/R）手术操作参照既往文献描述并稍加修改［3］。简而言之，手术区备皮、消毒，分离左侧颈总动脉（CCA），颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），于ICA 和ECA 分叉处结扎ECA。将线栓（L3200⁃3400）通过CCA 的小切口插入，并沿ICA 管腔进一步推动直至感觉到阻力，此时线栓硅胶部距分叉处约18-20 mm。最后缝合皮肤切口，并对切口处皮肤进行消毒。闭塞2 h后，将线栓轻轻取出，恢复脑血流灌注，并于再灌注时立即腹腔注射药物。在整个手术过程中，使用加热灯将直肠温度维持在（37.0±0.5）℃。大鼠从麻醉中恢复后可以自由进食饮水。

1.4 神经功能学评分（neural defect score，NDS）由一位观察者对所有大鼠于tMCAO/R 后24 h，以Longa 评分作为参照进行独立盲评：无神经功能缺损（0 分）；屈曲，内收和无法完全伸展的大鼠右前肢（1 分）；走路时向右转（2 分）；向右倾倒（3 分）；昏迷或无法自发行走（4 分）。

1.5 2，3，5⁃氯化三苯基四氮唑（2，3，5⁃triphenyl⁃tetrazolium chloride，TTC）染色大鼠于tMCAO/R后24 h 深度麻醉后处死（n=3/组），在1 分钟内迅速取出大脑并在-20℃冷冻10 分钟后，切为2 mm 厚度冠状脑片，置于37℃的黑暗环境，用1%TTC 染液正反面染色各20 min，经4%多聚甲醛固定4h取出，用数字摄影记录切片，并使用Image J 软件测量梗塞体积。根据以下公式计算梗塞体积的百分比：（测得的梗塞面积⁃水肿面积）/（全脑面积⁃水肿面积），其中（患侧半球面积⁃对侧半球面积）为水肿面积。

1.6 石蜡切片制备大鼠于tMCAO/R 后24 h 深度麻醉后处死（n=5/组），将SD 大鼠深度麻醉后，经主动脉用4℃预冷的生理盐水和4%多聚甲醛灌注，断头取脑，经4%多聚甲醛溶液固定24 h。梯度乙醇脱水后石蜡包埋。石蜡块制成5 μm 厚度切片用于尼氏染色以及3 μm 厚度切片用于苏木素⁃伊红（Hematoxylin⁃eosin，HE）染色和免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色。（1）尼氏染色切片脱蜡脱水，经甲苯胺蓝溶液中染色30 min，分化液分化后，置于苏木精溶液中染色1 min，常规干燥封片。光学显微镜400 倍镜下观察，每张切片均定位至大脑皮层五个随机的不同区域，计数富含尼氏体的神经元，并取其均值。尼氏小体在病理条件下可能溶解并消失。（2）HE 染色切片脱蜡脱水，苏木精溶液染色5 min，盐酸乙醇染色3 s，后置于伊红染液中1 min，常规干燥封片。光学显微镜400 倍镜下观察并收集图像。（3）IF 染色切片脱蜡脱水，在EDTA 抗原修复缓冲液（PH 8.0）中高压修复，滴加BSA 封闭30 min 后滴加一抗：兔多克隆抗GFAP 抗体、兔单克隆抗Iba 1 抗体，并置于4℃孵育过夜。滴加二抗置于在25℃下孵育50 min。将切片与DAPI 染料溶液在室温黑暗环境下孵育10 min。PBS 冲洗后，用抗荧光淬灭密封剂封片。荧光显微镜400 倍镜下观察，每张切片均定位至大脑皮层半暗带，并随机定位在1 个区域上收集图形并统计阳性细胞率。阳性细胞率=GFAP 或Iba 1 阳性细胞数目/DAPI 染色的细胞核总数。

1.7 统计学分析使用SPSS 21.0 统计软件进行统计分析。所有计量资料以（±s）表示，符合正态分布且方差齐的数据使用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较LSD⁃t 检验比较，若非正态分布或者方差不齐，使用Kruskal⁃Wallis 检验方法进行组间两两比较，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经功能评分见表1。

表1 PPVO 对大鼠神经功能评分、梗死面积以及存活神经元数目的影响

2.2 TTC染色见图1。

图1 各组大鼠脑TTC 染色结果

2.3 尼氏染色见图2。

图2 各组大鼠尼式染色结果

2.4 HE 染色见图3。

图3 各组大鼠HE 染色结果

2.5 IF 染色见图4。

图4 各组大鼠GFAP 和Iba 1 免疫荧光染色结果

3 讨 论

早期干预可以通过减轻CIRI，减轻缺血性卒中的致残率和死亡率，促进卒中患者早日康复。在本研究病理及胶质细胞染色表明：PPVO（30 mg/kg）可以明显减小梗死面积，改善神经功能缺损和病理损伤，同时还可以抑制半暗带星形胶质细胞和小胶质细胞激活，从而发挥神经保护作用。

星形胶质细胞和小胶质细胞是中枢神经系统中两种主要的胶质细胞，在脑组织受损时，发挥先天性免疫细胞作用，产生免疫应答。星形胶质细胞是中枢神经系统最大的胶质细胞，在正常生理状态下，参与调节突触活性，调节水和离子稳态，提供营养，清除有毒代谢产物以及参与形成血脑屏障等作用，且本研究发现，CIRI 后星形胶质细胞在半暗带大量激活。Nowicka 等［4］研究表明星形胶质细胞的激活在发病后4 小时-1 天开始，并在4天达到峰值，并在大鼠中持续到28 天。星形胶质细胞在缺血和再灌注损伤刺激下，迅速增殖和瘢痕形成，释放炎症因子，产生细胞毒性作用。且其作为血脑屏障（blood⁃brain barrier BBB）的重要组成部分，激活后形态肿胀，增加BBB 渗透性，促进血源性炎症细胞（如中性粒细胞）浸润至损伤区域，从而进一步加重神经元损伤。已知GFAP 作为星形胶质细胞的特异性标记物，其表达增加代表星形胶质细胞的增加。与本研究结果一致，有研究也证实GFAP 脑缺血后半暗带中表达明显增多，与神经元受损程度有关［5］。

小胶质细胞占神经胶质细胞总数的5%-20%，作为大脑固有的先天性免疫细胞，参与中枢神经系统的宿主防御功能。Iba 1 是小胶质细胞的细胞表面标记物，在损伤后脑组织中表达上调。小胶质细胞激活是急性脑损伤后炎症反应的第一步，并于缺血后2-3 分钟开始激活，并在2-3 天达到峰值，以释放破坏性促炎性介质为特征，导致半暗带区域的二次死亡［6］。本研究发现，脑缺血状态下，星形胶质细胞和小胶质细胞激活与脑损伤程度相关，且在再灌注24 h 后，小胶质细胞虽然激活明显增加，但其激活程度低于星形胶质细胞。给予PPVO 可抑制两者激活，其机制可能通过减轻免疫炎症反应，从而发挥脑神经保护作用。据前期对沙田柚的PPVO 成分分析可知，柠檬烯、β⁃月桂烯是PPVO 中含量最高的成分，且柠檬烯和月桂烯均已证实具有抗炎活性，因此我们推断PPVO 可能通过抑制炎症反应，从而发挥其神经保护作用［7］。

综上所述，本研究采用的tMCAO/R 模型在一定程度上模拟了临床上CIRI 的病理生理过程，并且证实了再灌注早期给予PPVO 可以降低缺血性脑卒中的损伤并抑制星形胶质细胞与小胶质细胞的激活。但PPVO 为多种活性成分的混合物，其脑保护作用可能是多靶点协同作用，具体的单体成分的相关活性及具体的保护机制仍需进一步探索。