南京市1例暴露感染HIV病例的溯源调查

董潇潇 许文炯 乔梦凯 毛子晴 张洪英 王燕 吴咏梅

作者单位：南京市疾病预防控制中心，江苏，南京210003

艾滋病（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的职业暴露是指工作人员在从事相关工作时被艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者/AIDS 病人（HIV/AIDS）的血液、体液污染了皮肤、粘膜，又或被含有HIV 的血液、体液污染的针头等利器刺破皮肤，有被HIV 感染的风险［1］。AIDS 职业暴露涉及到医疗卫生人员和人民警察，其中以医疗卫生人员为主［2⁃3］。传统的职业暴露后感染的认定主要依赖于随访期内暴露者HIV抗体是否发生阳转，而在某些特殊情况下，比如暴露者在暴露前、后6 个月内发生过易感染HIV 的行为，或是在暴露时未按照职业暴露处置管理的感染的溯源认定，则需要依赖分子流行病学检测技术。本市一例医务人员曾被某HIV 感染者气道分泌物污染了皮肤，暴露者在暴露后22 天检测其HIV 抗体为阳性，怀疑其为职业暴露后感染。本调查对其进行了分子流行病学溯源检测，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象及流行病学资料

医务人员（以下简称H），男，29 岁，曾在处置急诊病人（暴露源病人，以下简称S）时被其气道分泌物喷溅至手前臂，污染部位皮肤无破损，并立即以清水冲洗污染的皮肤。当时未按照职业暴露流程处置上报，不曾留取本底血清，也不曾服用药物进行暴露后预防。随后S 的入院检查结果显示HIV 抗体初筛阳性。暴露发生后的第22 天H 体检显示HIV 抗体筛查阳性，H 否认其他可能感染HIV 的高危行为，认为暴露后感染的可能性最大。本研究经伦理委员会批准同意。

1.2 研究方法

1.2.1 采样及血清学检测

暴露后第22 天用EDTA 抗凝管采集H 和S全血6 mL，立即颠倒混匀，3 000 r/min 离心15 min 后分离血浆留存。参照《全国艾滋病检测技术规范（2020 修订版）》［4］，首先进行HIV 抗体筛查实验，试剂为Bio⁃Rad 人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒第四代（酶联免疫法，批号：0A0488）和Alere 人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体检测试剂盒（胶体硒法，批号：98806K100A）；初筛阳性样本进行补充实验，试剂为MP 人类免疫缺陷病毒（HIV1+2）型抗体检测试剂盒（免疫印迹法，批号：AE9029）。

1.2.2 核酸提取及目的片段扩增

取200 μL 血浆，提取血浆中病毒RNA，使用医脉赛全自动核酸提取仪（EmagPure⁃96Plus）及配套试剂，提取方法参照试剂说明书。提取的RNA通过逆转录PCR 及巢式PCR 的方法扩增目的片段。目的片段包括HIV⁃1 聚合酶pol区、衣壳蛋白gag区及包膜蛋白env区基因片段。扩增试剂由大连宝生物工程有限公司生产，扩增引物见表1。

表1 HIV⁃1 PCR 扩增引物Table 1 HIV⁃1 PCR primers

1.3 测序及序列分析

目的产物经电泳鉴定无误后，扩增成功的HIV⁃1 pol 区、gag 区和env 区产物送至上海生工生物工程股份有限公司公司纯化并测序。反馈的基因序列使用Contig Express 校正和拼接，在美国洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV 核酸序列数据库（http：//www.hiv.lanl.gov）中比对，判断基因亚型。利用Mega 软件的Neighbor Joining 法针对不同目的基因将待溯源样本及其相似序列同各自参考序列分别构建系统进化树，同时计算基因距离，其中pol 区加入5 个已知亚型的南京本土HIV 感染病例的序列作为对照。

1.4 统计学方法

将基因距离录入Excel 表，使用SPSS 20.0 软件进行数据分析；进行成对样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清学检测结果

H和S血清学结果均为HIV抗体阳性；两者补充实验条带基本一致，S比H多一条p39条带。见表2。

表2 血清学检测结果Table 2 Serological test results

2.2 基因亚型及距离

H 和S 两份样本均成功扩增了HIV⁃1pol区、gag区和env区三个目的片段；三个区的基因亚型检测结果，H 均为CRF01⁃AE 型，S 均为CRF07⁃BC亚型；pol 区、gag 区和env 区序列H 与S 的基因距离分别为0.135、0.187、0.319，均大于H 与其对应相似株的基因距离，也大于S 与其对应相似株的基因距离。见表3。

表3 基因亚型及基因距离Table 3 Gene subtype and gene distance

2.3 系统进化树构建

HIV⁃1 pol 区序列系统进化树如图1 所示，样本H 与CRF01⁃AE 参考亚型聚为一簇，判断H 为CRF01⁃AE 亚型，而S 判为CRF⁃07BC 群。HIV⁃1 gag 区序列系统进化树见图2，H 与CRF01AE 亚型参考序列聚在一起，而S 与CRF07BC 亚型参考序列聚成一簇。HIV⁃1 env 区系统进化树如图3，H 判定为CRF01AE 亚型，而S 与CRF07⁃BC、CRF08⁃BC 两种亚型参考序列聚在一起，认定其为BC 重组亚型。

图1 溯源样本HIV⁃1 pol 区序列系统进化树Figure 1 Phylogenetic tree of HIV⁃1 pol region in traceable samples

图2 溯源样本HIV⁃1 gag 区序列系统进化树Figure 2 Phylogenetic tree of HIV⁃1 gag region in traceable samples

图3 溯源样本HIV⁃1 env 区序列系统进化树Figure 3 Phylogenetic tree of HIV⁃1 env region in traceable samples

3 讨论

HIV 感染的溯源调查可以有效地确定传染源，推测传播途径甚至明确传播方向。以往的溯源多依赖于流行病学调查与追踪［5］，而且流行病学调查对信息的准确性和详细度要求更高，也需要专业的访谈技巧。一旦出现被调查对象的不配合，线索有误或中断的情况，会影响调查结果，进而影响溯源的可靠性［6⁃7］。

HIV 分子溯源技术是利用分子生物学技术对有疑似传播关系的感染者体内的HIV 病毒进行同源性分析。HIV 病毒基因组为两条单正链RNA，每条约9.7 kb。本次溯源调查分别扩增了其中三个基因片段，包括编码聚合酶前体蛋白的pol区，以及编码衣壳蛋白和包膜蛋白gag区和env区。Pol区基因相对保守，通常用于分子流行病学的基因亚型检测［8⁃9］，gag区和env区变异速度更快，在溯源性分析中应用更多，尤其是包含高变异V3 环区的env基因区［10⁃12］。本次调查结果三个区的基因亚型结果互相符合，且不论是样本H 或S 与各自相似株的基因距离还是H 与S 的基因距离，均为pol

本调查采用的PCR 产物Sanger 测序的方法，是将巢式PCR 扩增产物纯化后直接测序，流程相对简单，是HIV 分子溯源技术中最基础的方法。在本研究结果从分子生物学角度，认为两者不存在传播关系。直接测序法对于传染源的确定具有很大的价值。然而判断已知传播关系的传播方向或是获得感染者体内更多准种的信息，则需要进一步用到高通量测序的方法［14］。

在职业暴露的溯源鉴定中，拥有先进的检测手段可以提供客观而真实的实验室证据，但职业暴露的规范化管理也显得尤为重要。首先要不断强化医务人员的生物安全意识，定期宣传培训，日常工作应当严格遵守操作规程，采用合适的防护。尤其是在接触高危人群/样本，或是从事风险较高的操作时要提高警惕，万不可有侥幸心理。医疗机构应当有详细的职业暴露应急预案及处置流程，处理伤口的同时，也要及时登记上报评估，并做好追踪工作［15］。该案例也提示，科学严谨的预防处置工作不仅可以提高职业暴露的溯源鉴定的效率，也可以降低暴露后感染HIV 的风险。