CEP164基因和CENPU基因多态性与精神分裂症的关联研究

汪昕 张旭 樊垚 魏来 沈冲 薛永★

作者单位：1.江苏省淮安市第三人民医院检验科，江苏，淮安223001

2.南京医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，江苏，南京210000

精神分裂症（schizophrenia，SZ）是一组发病机制复杂、原因未明的精神系统性疾病，具有情感、意志、行为、感知等多种精神异常表现，以精神表现与现实环境之间的不一致为主要特点［1］。SZ 的发生涉及遗传和环境因素的共同作用。全基因组关联研究（genome⁃wide association study，GWAS）发现了大量与SZ 相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。鉴于CEP164基因和CENPU基因在SZ 及其他精神疾病中的研究尚未见报道，本研究通过TaqMan 基因分型技术检测CEP164基因rs9163 位点和CENPU基因rs13478位点多态性，探讨CEP164基因和CENPU基因变异与SZ 之间的关系，旨在从分子生物学角度探讨CEP164基因和CENPU基因在SZ 人群中的遗传机制，初步探索miRNA 在SZ 发生中的下游相关分子机制，为临床诊断及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取淮安市第三人民医院2009年8月到2018年8月住院的SZ 患者2 555 例为病例组，其中男性1 173 例，女性1 382 例，平均年龄（34.72±13.08）岁。入选标准：符合《疾病和有关健康问题的国际统计分类》第10 版（ICD⁃10）诊断标准［2］。排除标准：脑器质性和躯体疾病所致精神障碍、精神活性物质所致精神障碍。患者病前无肥胖、糖尿病、高血压及内分泌疾病史，无相关遗传病史。同时选取同时期淮安市社区的健康人2 139 例为对照组，男性1 331 例，女性808 例，平均年龄（44.07±8.50）岁。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 的提取

研究对象均在早晨空腹条件下，用EDTA 抗凝采血管采集静脉血5 mL。在24 h 内对血样本进行4 000 转离心10 min，血浆分离至1.5 mL 离心管中。剩余血样本留存放置于-80℃冰柜中保存。DNA 提取采用酚氯仿法。

1.2.2 SNP 位点的选择

应用生物信息学预测软件PolymiRTS Database 3.0（2013）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的dbSNP 数据库，进一步筛选重复验证可能与SZ 相关联的遗传位点进行研究，最终选择CEP164基因rs9163 位点和CENPU基因rs13478 位点。

1.2.3 基因分型

应用美国ABI 公司Taqman⁃MGB 探针技术完成研究对象的基因分型。针对rs9163 和rs13478两个SNP 位点分别设计聚合酶链式反应（PCR）引物和TaqMan 探针，进行实时荧光PCR 扩增。PCR扩增在ABI 9700 PCR 仪上读取，实验结果通过分析软件SDS 2.3 获得。整个PCR 反应体系的体积为4.2 μL，具体包括1.6 μL 的Mix 预混液，正向引物和反向引物各0.1 μL，两种探针各0.1 μL，去离子水1.2 μL，DNA 模板1 μL。

PCR 反应程序为：50℃预反应2 min，95℃预变10 min；PCR 扩增95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，45 个循环。rs9163 位点多态性PCR 正向引物：5′⁃CCACAACGGCAGCATCTCCA⁃3′，反向引物：5′⁃TCCTCCTGGGACACTTTGGGT⁃3′，TaqMan探针序列为5′⁃CAGGGCCAGGCAC⁃3′和5′⁃CCAGGG CCGGGCA⁃3′；rs13478 位点多态性PCR正向引物：AGGTAACAGCATGAGACTCGTCTT CCT⁃3′，反向引物：TCTGGGAGCCGAAAGCCATC⁃3′；TaqMan 探针序列为5′⁃TAGACTGCTCTTCT⁃CATC⁃3′和5′⁃TAGACTGCTTTTCTCATC⁃3′。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。采用多元Logistic 回归模型分析基因位点多态性与SZ 的关联性，计算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI），并校正年龄、性别协变量。健康对照组基因型进行Hardy⁃Weinberg 平衡定律检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CEP164 基因和CENPU 基因多态性与SZ 的关联分析

C 和T 等位基因在健康对照组中的分布频率分别为85.6%和14.4%（rs9163 位点），67.7%和32.3%（rs13478 位点），符合Hardy⁃Weinberg 定律（P>0.05）。Logistic 回归分析显示，在调整性别和年龄后，rs9163 位点和与rs13478 位点相加模型、显性模型和隐性模型与SZ 的关联均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 CEP164 基因和CENPU 基因多态性与SZ 发生风险的关联分析Table 1 Association analysis of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism with SZ risk

2.2 CEP164 基因和CENPU 基因变异与SZ 发生风险的性别分层分析

Logistic 回归分析显示，在调整年龄后，无论是男性还是女性人群中，rs9163 和与rs13478 位点与SZ 关联无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 性别分层分析CEP164 基因和CENPU 基因多态性与SZ 的发生风险Table 2 Gender stratified analysis of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism and the risk of SZ

2.3 CEP164 基因和CENPU 基因变异与SZ 发生风险的家族史分层分析

根据SZ 患者有无家族史为变量对研究对象分层，并调整年龄和性别，Logistic 回归分析显示，rs9163 和与rs13478 位点多态性与SZ 关联均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 家族史分层分析CEP164 基因和CENPU 基因多态性与SZ 的发生风险Table 3 Stratified analysis of family history of CEP164 gene and CENPU gene polymorphism and the risk of SZ

3 讨论

自2008年第1 篇关于SZ GWAS 分析的文章发表以来［3］，通过GWAS 分析已发现许多与SZ 相关的SNP［4⁃6］。以SZ 为焦点的GWAS 发现也具有交叉表型意义。研究发现rs13107325 T 等位基因与SZ、体重指数、高密度脂蛋白胆固醇、血压以及N 端前脑钠素（N⁃terminal forebrain natriuretic hor⁃mone，NT⁃proBNP）相关［7⁃12］。Verena 等［13］在染色体15q25.1 上的CHRNA3/CHRNA5/CHRNB4簇中发现了SZ 与肺癌的共同突变位点，另外两个位点（6p22.1 和11q12.1）在肺癌和SZ 的相关组织类型中显示交叉表型关联和基因表达的下游多向效应。本研究尚未发现CEP164基因和CENPU基因位点多态性与SZ 存在显著性关联，是否还有其他因素，如SZ 患者的生活环境、身体活动水平、其他疾病等因素影响rs9163 和rs13478 位点多态性对SZ 的发生风险有待深入探讨。

miRNA为一类长度约为18～25个核苷酸（nt）、具有高度保守性的非编码的微小RNA，通过与靶基因的3′非翻译区（3′Non⁃translation area，3′UTR）结合，抑制靶基因的翻译过程或者降解靶基因mRNA 而在基因转录后水平起到调控作用［14］。研究表明，精神障碍性疾病的易感基因变异及相应的生物学功能的改变与miRNA 表达量或者结构改变有关联［15］。本研究前期实验表明miR⁃328、miR⁃886⁃5p、miR1243、miR⁃663b、miR⁃1274a 可能参与SZ的发病机制。

位于靶基因mRNA 3′UTR 区miRNA 结合位点内的SNP 将会影响miRNA 与mRNA 的结合，从而使miRNA 对mRNA 的调控过程受阻。近年来，人们已经发现若干个位于miRNA 结合位点的SNP 对SZ的发生发展具有影响。William 等［16］发现miR⁃616与H3F3B转录本的结合会被位于H3F3B3′UTR 内的rs1060120 的等位变异所改变，rs1060120 A 等位基因显著降低了荧光素酶的表达，表明A 等位基因与miR⁃616的相互作用强于G等位基因，从而通过下游效应增加了SZ 谱系诊断的风险。Hou等［17］通过对GWAS SZ 相关变异位点的检索发现，位于FURIN基因3′UTR 区rs4702⁃G 可通过增加miR⁃338⁃3p 的结合能力而参与FURIN的表达下调，而FURIN的表达量降低将导致成熟脑源性神经营养因子（brain de⁃rived neurotrophic factor，BDNF）的生成减少，后者的降低已经报道与SZ 的发生相关。这些结果证实了位于miRNA 结合位点的SNP 可能改变SZ 的表观遗传机制，从而增加SZ 相关疾病的风险。本研究应用miRNA 靶基因预测软件预测差异表达的miRNA 结合区域有2 个SNP 位点，分别为rs9163 位点和rs13478 位点，这两位点在SZ 及其他精神疾病中的研究暂未见报道。本研究尚未发现这两位点多态性与SZ 存在显著性关联，推测miRNA 并非通过结合rs9163 位点和rs13478 位点调控SZ 的发生，很有可能通过其他信号通路参与SZ的发生和发展。

现有的预测软件或网站只能从生物信息学方面预测位于miRNA 结合位点的SNP 对miRNA 结合mRNA 的影响，具体的功能还需要构建荧光报告载体验证。本研究初步表明了CEP164基因rs9163 位点和CENPU基因rs13478 位点变异与SZ的关系。为进一步探讨这两位点与SZ 的关系，后续实验将会检测CEP164基因和CENPU基因在SZ 病例组和健康对照组中的表达，以及采用荧光素酶报告基因实验验证CEP164基因和CENPU基因是否是miRNA 的靶基因。