EMT标志物在胎膜早破患者羊膜上皮细胞中的表达及意义

陈静宁 许静芸 罗晓薇 张元鑫 吴盛桂 宫国良★

作者单位：1.汕头市金平区妇幼保健院妇产科，广东，汕头515044

2.汕头大学医学院第一附属医院病理科，广东，汕头515044

3.汕头潮南民生医院病理科，广东，汕头515044

胎膜早破（Premature rupture of membranes，PROM）是最常见的产科疾病之一，临床上分为早产PROM（preterm premature rupture of membranes，PPROM）和足月PROM（Term premature rupture of membranes，TPROM）。PROM 是早产的主要原因，会引起各种并发症，其中不乏胎儿死亡等严重情况［1⁃2］。对PROM 的机制研究，一直是临床热点，尽管已经提出了各种潜在的机制，但其确切的机制尚不清楚，最新的研究表明上皮间质转化（Epithe⁃lial⁃mesenchymal transition，EMT）在胎膜早破的发生中有密切联系，EMT 参与了PROM，并且发挥了重要作用［3⁃4］。在以往的研究中，大多选用聚合酶链式反应或者蛋白质印迹等方法检测胎膜中EMT的标志物的表达情况［5］，而对于胎盘羊膜上皮细胞中EMT 的标志物的免疫组化检测研究且较少，本文将探讨EMT 标志物在PROM 中的表达情况，阐述EMT 在胎膜早破中的作用机制，旨在为PROM的预测、诊断及治疗及提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 一般材料

选取本院2017年1月1日至2020年12月31日产科因PROM 而住院的患者，经伦理委员会批准共收集PROM 患者胎盘221 例，其中TPROM 143 例，年龄（25.97±4.48）岁，孕周（39.13±1.32）周；PPROM 78 例，年龄（26.87±5.52）岁，孕周（33.31±2.53）周；并收集同一时间段正常产胎盘51 例作为对照组，年龄（26.12±5.03）岁，孕周（39.31±1.41）周。所有患者均同意将胎盘送至病理科检查及参与科学研究。纳入标准：PROM 纳入标准包括诊断为PROM，且妊娠大于26 周的患者，并有完整的病例信息记录。排除标准：排除多胎妊娠、畸形、试管婴儿及妊娠期常见疾病，如妊娠期糖尿病和先兆子痫，以及明确的产妇及胎儿感染。

1.2 方法

1.2.1 患者的基本临床信息

收集的病例均以胎膜早破为第一诊断入院，采集的临床数据均为入院后第一次记录或检查结果，包括产妇年龄、孕产次、白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、凝血酶原时间、总蛋白量、白蛋白量、球蛋白量、白/球比例信息。

1.2.2 免疫组织化学染色及评估

标本经10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片及染色。E⁃Cadherin 单克隆抗体（克隆号：MX020，稀释度1∶100）、Vimentin 单克隆抗体（克隆号：MX034，稀释度1∶100）均购自中国福州迈新生物技术开发有限公司；MMP9 单克隆抗体（克隆号：56⁃2A4，稀释度1∶300）、TIMP1 单克隆抗体（克隆号：EPR18352，稀释度1∶300）均购自英国Abcam 公司。免疫组织化学采用深圳达盟生物科技有限公司全自动免疫组化染色系统，机器型号为AS300。由胎膜破裂位置开始在欧林巴斯B51 显微镜下观察，由两位病理医生进行免疫组化评分。参考免疫反应评分（IRS）［6］，结果以染色强度×阳性细胞百分比表示，在染色强度和阳性细胞百分比的基础上进行评估免疫组化指标。其中E⁃Cadherin、MMP9、TIMP1 基本所用的病例均出现不同程度的阳性表达，因此分类上采用强表达和弱表达来表示，Vimentin 出现部分阴性表达病例，采用强表达、弱表达、阴性三分类。由于部分病例出现羊膜上皮细胞脱落，因此，免疫组化只染色能够完整显示羊膜上皮细胞的病例。

1.3 统计分析

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析；计数资料以n（%）表示，行χ2检验，多组事后两两比较使用FDR 校正P值；计量资料以（）表示；使用Shap⁃iro⁃Wilk 检验是否服从正态分布；服从正态分布的，使用Levene 检验是否方差相等。方差相等的，使用方差分析。当方差分析差异有统计学意义的，使用SNK 检验事后两两比较；方差不相等的，或不服从正态分布的，使用Kruskal⁃Wallis 检验。当Kruskal⁃Wallis 检验差异有统计学意义的，使用Nemenyi 检验进行事后两两比较。E⁃cadherin、vimentin、MMP9、TIMP1 组间比较采用方差分析；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组基本资料比较

在孕、产次上比较，对照组>PPROM 组>TPROM 组，差异有统计学意义（P<0.05）。3 组间年龄、白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白值、血小板计数、凝血酶时间、白蛋白、球蛋白指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 胎膜早破组与对照组基本资料比较［M（Q1⁃Q3），（±s）］Table 1 Comparison of basic data between premature rupture of membranes group and control group［M（Q1⁃Q3），（±s）］

表1 胎膜早破组与对照组基本资料比较［M（Q1⁃Q3），（±s）］Table 1 Comparison of basic data between premature rupture of membranes group and control group［M（Q1⁃Q3），（±s）］

注：组间比较差异有统计学意义，aP<0.05；b 为方差分析得到P 值，其他均为Kruskal⁃Wallis 检验得到P 值。

项目年龄白细胞中性粒单核细胞红细胞血红蛋白血小板凝血酶原时间总蛋白白蛋白球蛋白白球比例孕次产次n n n 51 51 51 51 51 51 51 50 51 51 51 51 51 51足月对照26.00（22.00～30.00）10.08（8.31～12.63）6.98（5.71～9.43）0.64（0.54～0.86）4.03（3.68～4.16）112.76±16.21 212.00（178.50～250.50）9.50（9.12～9.80）62.80（59.85～66.20）33.20（31.65～35.10）29.60（28.00～31.25）1.12（1.06～1.23）2.00（1.00～3.00）2.00（1.00～2.00）78 78 78 78 78 78 78 71 73 73 73 73 78 78 PPROM 组26.00（23.25～30.00）10.55（9.28～13.73）7.33（6.04～9.96）0.78（0.62～0.99）3.79（3.56～4.08）109.85±12.44 218.50（194.00～256.75）9.70（9.38～10.12）61.60（58.90～65.30）33.40（31.40～35.40）28.10（26.00～30.40）1.17（1.05～1.34）2.00（1.00～2.00）2.00（1.00～2.00）143 143 143 143 143 143 143 130 143 143 143 142 143 143 TPROM 组26.00（23.00～28.00）10.54（8.91～12.70）7.00（5.90～9.26）0.70（0.52～0.90）3.88（3.61～4.12）109.10±16.38 230.50（172.50～271.75）9.60（9.20～10.00）61.95（59.60～64.40）33.10（31.50～34.70）29.40（26.60～31.08）1.14（1.04～1.29）1.00（1.00～2.00）1.00（1.00～2.00）统计量1.319 2.515 1.674 7.068 5.429 1.075 1.676 3.360 1.793 0.959 3.909 3.069 8.896 13.482 P 值0.517 0.284 0.433 0.029 0.066 0.343b 0.433 0.186 0.408 0.619 0.142 0.216 0.012 0.001

2.2 EMT 标志物在胎膜早破患者胎盘羊膜上皮细胞中的表达

E⁃cadherin 在各组中均出现阳性表达，并且以强阳性为主，各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）；Vimentin 在3 组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；MMP9 和TIMP1 在各组间表达比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、图1。

表2 EMT 标志物在胎盘羊膜上皮细胞中的表达情况［n（%）］Table 2 Expression of EMT markers in placental amniotic epithelial cells［n（%）］

图1 Vimentin、MMP9、TIMP1 在胎膜早破患者胎盘羊膜上皮细胞中的表达（SP，×400）Figure 1 Expression of Vimentin，MMP9 and TIMP1 in placental amniotic epithelial cells of patients with premature rupture of membranes（SP，×400）

3 讨论

羊膜表面为上皮细胞，上皮细胞下为致密的胚外中胚层，含较多的肌纤维母细胞。肌纤维母细胞能够产生胶原纤维，因此保持足够数量的肌纤维母细胞是保障羊膜强度的关键因素。目前的研究认为，肌纤维母细胞的来源有以下几种方式：间质固有肌纤维母细胞活化；循环中来源于骨髓的纤维母细胞迁入；除了这两种主要来源外，上皮细胞可以通过EMT 转化为肌纤维母细胞，参与组织纤维化修复以补充肌纤维母细胞的数量，来维持生理功能的稳定，EMT 是指上皮细胞在特定的条件下发生程序性转化，经过细胞骨架重塑，转变成具有迁移能力的间叶细胞的过程。EMT 不仅存在胚胎发育过程中，同时还参与了组织再生、器官纤维化以及肿瘤浸润转移等过程，从组织的修复理论上来说，EMT 参与胎膜早破的过程也是合理的［7］。

大部分理论认为，PROM 由多个因素引起，炎症、基质金属蛋白酶（MMPs）、细胞因子、细胞凋亡和氧化应激等均参与其中［8⁃9］，而EMT 与PROM 的关系研究是近几年才出现的，理论体系尚不十分完整。对于EMT 的研究，首先是选取标志物，不同研究文献中选用的标志物大同小异［10］，本研究选用比较常见的、意义明确的EMT 标志物，分别为：E⁃cad⁃herin、Vimentin、MMP9、TIMP1。E⁃Cadherin 是主要的EMT 标志物，其减少或丢失是EMT 的标志性改变。有关EMT 和PROM 的研究文献中，大多数都会选取该指标，但研究方法很少采用免疫组化法，本研究结果这体现出免疫组化的弊端，免疫组化是最好的定性指标，广泛应用于临床和科研中，但其没有精确定量的功能。因此，在免疫组化水平，E⁃Cadherin 无法应用于EMT 与PROM 关系研究。研究中Vimentin，MMP9，TIMP1 均出现差异性表达，针对于胎膜早破的EMT 机制研究，这3 个指标在免疫组化水平可以应用。Vimentin、MMP9、TIMP1 均为常用的EMT 标志物，其中以Vimentin意义最为突出，Vimentin 是最典型的间叶细胞标志物，Vimentin 在羊膜上皮细胞中出现阳性表达，代表着羊膜上皮细胞向间叶细胞转化这一EMT 过程。MMP9 和TIMP1 在各组间表达比较，差异有统计学意义，本研究和文献报道结果一致［11⁃12］。

有关PROM 与EMT 的研究并不多，最有代表性的是Haruta Mogami 分别于2017年和2018年在同一期刊发表的两篇论著［3⁃4］，对EMT 在胎膜早破中的作用进行了动物实验，研究发现，小破裂引起细胞因子的瞬时上调，而大破裂引起胎膜中促炎细胞因子的持续上调。来自羊膜的胎儿巨噬细胞被募集到破裂的羊膜中，其中巨噬细胞粘附分子被高度表达。招募的巨噬细胞释放IL⁃1β 和TNF，促进EMT 和上皮细胞迁移。该研究为EMT 在PROM 中的作用机制奠定了实验基础。Carla Janzen 于2017年发表了题目为《The Role of Epithelial to Mesenchymal Tran⁃sition in Human Amniotic Membrane Rupture》的论著［5］，通过对人类胎膜和羊膜上皮细胞的研究，提出在PPROM 的羊膜中，EMT 作用增强，研究从免疫组化角度证实了这一理论。希望通过新的理论，能够提出针对EMT 的治疗手段，达到预防和治疗胎膜早破这一产科常见疾病的目的。

综上所述，EMT 参与了PROM 的发病过程，免疫组化方法检测vimentin、MMP9、TIMP1 在羊膜上皮细胞中的表达可以作为其发生EMT 标志物，在临床工作中，通过干预EMT 这一病理过程，有望成为治疗胎膜早破的一个新思路。